PTFE血管材料可攜載VEGF基因轉(zhuǎn)染

醫(yī)案日記 2023-06-18 21:08:39

PTFE血管材料可攜載VEGF基因轉(zhuǎn)染

近日，浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院普外科陶思豐博士等研究首次證實

，聚四氟乙烯（PTFE）血管材料攜載的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因，可轉(zhuǎn)染種植在其表面的內(nèi)皮細胞

，并能促進內(nèi)皮細胞生長

。

研究據(jù)介紹

，隨著基因治療血管性疾病研究的深入，人們開始應(yīng)用基因來改造人工血管

。但選擇什么樣的基因進行轉(zhuǎn)染，如何使攜載基因能促進內(nèi)皮細胞的生長

，已成為該領(lǐng)域研究的熱點。

為突破這一研究瓶頸

，陶思豐等研究人員采用體外實驗研究的方法，選用PTFE為血管材料載體

，將pC鄄DI-hVEGF121質(zhì)粒溶液注入PTFE人工血管，使其質(zhì)粒進入人工血管壁的孔隙中

。接著，將從人臍靜脈中分離培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞

，種植到攜帶VEGF基因質(zhì)粒的PTFE材料表面，經(jīng)6

、24、72和120小時時間點的傳代培養(yǎng)后

，用ELISA法對照檢測種植的內(nèi)皮細胞增殖和VEGF蛋白的表達情況

。

檢測結(jié)果顯示：在24

、72和120小時各時間點內(nèi)

，VEGF質(zhì)粒組中內(nèi)皮細胞的黏附率明顯高于空白對照組（P

研究人員認為，VEGF是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞生長作用最強

、特異性最高的一種生長因子，而PTFE作為良好的人工血管材料載體

，自身具有多孔特性

，可使VEGF基因質(zhì)粒穩(wěn)定進入其管壁孔隙中黏附和釋放，其機制可能是：PTFE材料與內(nèi)皮細胞緊密接觸

，為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞提供了空間；纖維連接蛋白和基因質(zhì)粒的混合

，提高了質(zhì)粒與組織細胞的相容性，通過黏附分子受體與纖維蛋白作用后的內(nèi)吞效應(yīng)

，介導(dǎo)了基因質(zhì)粒的協(xié)同入胞。本研究表明

，PTFE血管材料可攜載VEGF基因質(zhì)粒，并能轉(zhuǎn)染種植在VEGF表面的內(nèi)皮細胞

，促進其快速生長。這一結(jié)果

，為PTFE人工血管材料的廣泛應(yīng)用開辟了新前景。

rna干擾技術(shù)論文怎么寫(2)

rna干擾技術(shù)論文篇二
RNA干擾技術(shù)在消化系腫瘤基因治療中的應(yīng)用

【關(guān)鍵詞】 RNA干擾小干涉RNA 消化系腫瘤基因治療

RNA干擾(RNA interference

，RNAi)是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(double stranded RNA

，dsRNA)所誘發(fā)

，高度特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA

，使基因沉默的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平

，故又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post?transcriptional gene silencing，PTGS)[1]

。RNAi是生物體在進化過程中抵御病毒入侵，抑制由轉(zhuǎn)座子移動或重復(fù)序列的積累引起的基因組不穩(wěn)定的保護機制

，另外還是基因表達調(diào)控的一條重要途徑。小干涉RNA(small inter?fering RNA

，siRNA)是指干涉RNAi過程中在細胞內(nèi)產(chǎn)生的長約21～23核苷酸(nt)的小雙鏈RNA分子

，是RNAi發(fā)揮功能的重要中間效能分子。RNAi自從1998年發(fā)現(xiàn)以來

，就以其獨特的優(yōu)勢在功能基因組學研究中迅速占有一席之地，迄今已成為基因研究中不可或缺的工具之一

，并且隨著對其作用機制的逐步了解和應(yīng)用技術(shù)的日漸成熟，已開始應(yīng)用于疾病防治等多個方面。本文就其機制

，主要特征，以及在消化系腫瘤中的研究作一簡單綜述

。

1 作用機制及主要特征

1.1 作用機制

RNAi在哺乳動物細胞中有兩種作用機制：一種是大于30 nt的長雙鏈RNA(dsRNA)產(chǎn)生的廣泛的、非特異性效應(yīng)

。其機制可能是激活了細胞內(nèi)的蛋白激酶R和RNA酶L，從而導(dǎo)致了非特異性的細胞凋亡

。另一種是21～23 nt的短雙鏈RNA(siRNA)產(chǎn)生的相對具體的、特異性效應(yīng)

。目前，RNAi在抗病毒及腫瘤中的研究主要集中在siRNA產(chǎn)生的特異性效應(yīng)

，故下面主要介紹siRNA的作用機制。

siRNA的作用機制目前尚未完全闡明

，但已基本達成共識，即①dsRNA在細胞內(nèi)與DICER酶(一種RNAaseIII家族中特異性識別dsRNA的酶)結(jié)合

，隨即被分割成21～23個核苷酸的短鏈dsRNA，在這個過程中需要ATP的參與

。②分割下來的短鏈dsRNA即為siRNA，它是RNAi的起始誘導(dǎo)物

，與DICER酶形成RNA引導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)

，此時RISC無活性，隨后

，siRNA經(jīng)歷一個依賴ATP的解雙鏈過程激活RISC[2]。③siRNA特異性地識別靶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA

，并引導(dǎo)RISC結(jié)合mRNA，RISC中的DICER酶將mRNA切割成21～23個核苷酸片段

，此后mRNA被逐步降解，導(dǎo)致不能進行翻譯過程

，從而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表達

。④新產(chǎn)生的dsRNA(siRNA)可繼續(xù)形成RISC復(fù)合物進入新一輪RNAi的循環(huán)，產(chǎn)生正反饋效應(yīng)

。這一過程需在RNA依賴RNA聚合酶(RdRP)的條件下進行。除上述機制外

，轉(zhuǎn)基因真核生物dsRNA 還可引起相應(yīng)基因的甲基化，促使異常RNA產(chǎn)生

，最終導(dǎo)致基因沉默[3,4]。

1.2 主要特征

1.2.1 高度特異性 RNAi嚴格遵循堿基配對原則

，只降解與之同源的基因的RNA，達到阻止基因表達的目的

。

1.2.2 高效性相對很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠遠少于mRNA的數(shù)量)就能完全抑制相應(yīng)基因的表達，在哺乳動物中雖沒發(fā)現(xiàn)擴增效應(yīng)

，但在細胞實驗中只需摩爾級濃度的 siRNA 即可有效抑制目標基因的表達。

1.2.3 可傳遞性和可遺傳性 RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可跨越細胞的界限

，甚至可以傳播至整個有機體及子代細胞。

1.2.4 濃度

、時間雙重依賴性在一定時間內(nèi)RNAi的效應(yīng)強度隨siRNA的濃度增高而增強

，或濃度一定的情況下，隨著時間延長

，siRNA在細胞內(nèi)發(fā)生正反饋效應(yīng)，導(dǎo)致濃度增高

，使RNAi效應(yīng)增強。

1.2.5 ATP依賴性目前研究發(fā)現(xiàn)RNAi中至少有2個步驟消耗ATP[5]：DICER酶切割dsRNA成為siRNA并使其5?端磷酸化或胞內(nèi)磷酸化酶使導(dǎo)入的siRNA 5?端磷酸化而使其成為有活性的siRNA的過程;RISC活化即siRNA解雙鏈的過程

。

2 RNAi在消化系腫瘤治療中的應(yīng)用

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因的激活

，抑癌基因的失活，以及凋亡相關(guān)基因的異常表達等均有密切的關(guān)系。因此我們可以針對這些因素

，利用RNAi相關(guān)技術(shù)在不影響正?div id="4qifd00" class="flower right">

；蚬δ艿臈l件下抑制突變基因表達或基因的表達過量

，從而達到基因治療的目的。另外

，腫瘤是多個基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，當單一癌基因的阻斷不能完全抑制或逆轉(zhuǎn)時

，可以設(shè)計一種針對同一家族多個基因的保守序列的siRNA分子，便可以同時抑制這一家族的多個基因表達

，且抑制效果互不干擾。

2.1 原癌基因

原癌基因是細胞基因組內(nèi)正常的組成成分

，自然狀態(tài)下無致癌作用，其主要作用是通過編碼生長因子等調(diào)節(jié)正常細胞的生長

、分化

。原癌基因激活是腫瘤發(fā)生的根本原因之一

，因此

，如何抑制原癌基因的激活成為目前研究腫瘤治療的熱點之一。

2.1.1 Ras基因 Ras基因是目前已知的在人類腫瘤中呈活化狀態(tài)最普遍的原癌基因

，有數(shù)據(jù)顯示此基因的突變現(xiàn)象存在于30%～50%的腫瘤組織中，在胰腺癌中可高達85%

。Brummelkamp等[6]建立了突變體的表達系統(tǒng)即pSUPER?K?rasv12，轉(zhuǎn)染人胰腺癌CAPAN?1細胞系后

，觀察到pSUPER?K?rasv12能顯著降低K?rasv12的mRNA表達水平。構(gòu)建突變體K?rasv12的siRNA病毒載體轉(zhuǎn)染CAPAN?1細胞亦能抑制細胞克隆生長

，并阻止裸鼠腫瘤的形成;而對照組細胞生長良好并產(chǎn)生克隆，體內(nèi)裸鼠實驗5周內(nèi)均長出腫瘤

，因此證明了該siRNA具有明顯的特異性和抑制腫瘤生長的作用。同時

，他們采用反轉(zhuǎn)錄病毒載體RNA系統(tǒng)在體外也成功地抑制了ras基因的表達。

2.1.2 Fos基因 Fos基因是一個重要的促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的基因

，其產(chǎn)物Fos蛋白與腫瘤細胞的運動有關(guān)

。Fra?1蛋白是Fos蛋白家族的成員之一

，主要在大腸癌Hct?116細胞株和BE細胞株中表達。用siRNA 轉(zhuǎn)染fosL基因

，然后再轉(zhuǎn)染到BE細胞中，發(fā)現(xiàn)Fra?1蛋白對細胞的增殖沒什么影響

，卻極大地降低了BE細胞的運動能力

，大約降低為原來的1/10[7]

。

2.2 抑癌基因

由于抑癌基因在細胞增殖調(diào)控中起重要作用，因此也成為基因治療的重要目標之一

。p53基因是最早利用RNAi技術(shù)研究的基因之一，人體內(nèi)大約50%腫瘤的發(fā)生是p53基因突變的結(jié)果。p53基因能夠抑制DNA合成及誘導(dǎo)DNA修復(fù)來抑制細胞生長

，使細胞停滯在G1期。突變型p53失去對細胞增殖的負調(diào)控作用

，導(dǎo)致細胞增殖失控發(fā)生癌變。Martinez等[8]的報道中

，將H1299細胞轉(zhuǎn)染野生型p53和突變型p53的RNA表達型質(zhì)粒，結(jié)果

，野生型siRNA明顯抑制野生型p53蛋白的表達

，對突變型幾乎無效;而突變型siRNA顯著抑制突變型p53蛋白表達

，野生型基因則不受影響。由此證明

，RNA序列能特異性地分別抑制這兩個基因的表達，并且對突變型p53的抑制可在一定程度上恢復(fù)野生型基因的表達和功能

。這就為選擇性和個體化治療腫瘤提供了可能

。

2.3 細胞凋亡相關(guān)基因

細胞增殖和凋亡之間的動態(tài)平衡對于機體的生長發(fā)育有著舉足輕重的影響

。凋亡過程的失調(diào)可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生

。有研究表明[9]

，將表達有綠色熒光蛋白(GFP)的Bcl?XLsiRNA轉(zhuǎn)染人胃癌細胞株MGC?803

，用RT?PCR和免疫熒光法檢測Bcl?XL的表達

，48 h后發(fā)現(xiàn)

，與siRNA陰性組相比，實驗組GFP明顯減少

，Bcl?XL蛋白和Bcl?XL mRNA表達減少到基準水平以下，并有自發(fā)的細胞凋亡現(xiàn)象

，凋亡率達21.17%

。這就說明Bcl?XL特異性siRNA能夠抑制凋亡抑制基因Bcl?XL的表達，從而誘導(dǎo)胃癌細胞株MGC?803凋亡

。

2.4 其他相關(guān)基因

2.4.1 Her2基因 Her2基因在胃癌等腫瘤的發(fā)病中起到重要作用，尤其見于彌散型胃癌

。有研究表明將核仁蛋白NoL8特異性siRNA轉(zhuǎn)染3種彌漫型胃癌細胞ST?4，MKN45

，TMK?1，可以有效地降低該基因的表達

，并能誘導(dǎo)這些細胞發(fā)生凋亡。因此

，可以考慮把Her2作為胃癌基因治療的又一新的靶點[10]

。

2.4.2 連環(huán)蛋白和APC基因連環(huán)蛋白和APC基因是WNT信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵成分

。這些基因的突變可引起連環(huán)蛋白表達水平增加，導(dǎo)致細胞過度增生

，促進結(jié)腸息肉和結(jié)腸癌的發(fā)生

。Verma等[11]構(gòu)建了連環(huán)蛋白的多個靶區(qū)域，使得蛋白表達量降低90%

。有學者進一步用轉(zhuǎn)染連環(huán)蛋白siRNA 的結(jié)腸癌HCT116細胞注射裸鼠

，發(fā)現(xiàn)有50%的老鼠存活超過70 d

，而對照組則全部死亡。

2.4.3 血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF) VEGF是體內(nèi)一種重要的促血管生成因子，在惡性腫瘤的發(fā)生

、發(fā)展及預(yù)后過程中均有著極其重要的作用

。Zhang等[12]設(shè)計了針對鼠VEGF各亞型的siRNA

，以DNA為模板在細胞內(nèi)誘導(dǎo)小片段雙鏈RNA的形成

，干擾結(jié)果均特異性抑制相應(yīng)VEGF的表達

。同時

，Takei等[13]設(shè)計了針對人VEGF的siRNA，采用體外合成法得到相應(yīng)的siRNA，將其注入到荷瘤鼠模型的腫塊中

。結(jié)果腫瘤組織中的VEGF在mRNA水平和蛋白水平的含量明顯低于對照組

，腫瘤體積亦明顯小于對照組

。徐文華等[14]設(shè)計兩組針對VEGF?mRNA 的siRNA,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胃腺癌細胞系SGC?7901,觀察其細胞周期的變化

。發(fā)現(xiàn)G0/G1期細胞增多, S期細胞減少,細胞周期阻滯于G0/G1期;并能誘導(dǎo)細胞凋亡產(chǎn)生凋亡小體。這些結(jié)果無疑將給腫瘤的基因治療提供了新的思考方向。

2.4.4 TGF1 TGF1是一種多功能生長調(diào)節(jié)因子

，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切

。它可使胃癌細胞表達的黏附分子如CD44表達增多;抑制腹腔內(nèi)淋巴細胞活性使其無法有效殺傷腹腔內(nèi)游離癌細胞以及血管生成

，同時可使間皮細胞變形，腹膜纖維化等

。吳濤等[15]利用載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)干擾TGF1，發(fā)現(xiàn)TGF1蛋白在人胃癌細胞株SGC?7901中下降約65.8%，腹膜間皮細胞TGF1蛋白下降約61.8%

。這一結(jié)果有力證明了siRNA能抑制TFB1在人胃癌細胞株SGC?7901和腹膜間皮細胞中的表達

，為今后胃癌腹膜轉(zhuǎn)移靶向治療奠定了堅實的基礎(chǔ)

。

2.4.5 埃茲蛋白(Ezrin) Ezrin作為ERM (ezrin radixin moesin)蛋白家族的成員,是一種細胞膜與細胞骨架的連接蛋白

，其主要功能是參與細胞的生長和信號轉(zhuǎn)導(dǎo),接受胞外信號,使骨架蛋白重新排布,并增加細胞運動能力

。近來發(fā)現(xiàn), Ezrin的表達與大多數(shù)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān),如Ezrin表達水平與黑素瘤的分級[16]和乳腺癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移[17]均呈正相關(guān)。顏歌等[18]采用小干擾RNA 方法抑制腸癌細胞系Lovo和SW480中的Ezrin的表達,發(fā)現(xiàn)Ezrin mRNA和蛋白表達水平均顯著下調(diào)

，腫瘤細胞的運動侵襲能力下降,穿過人工基底膜的細胞數(shù)量明顯減少

。這預(yù)示Ezrin蛋白有可能成為抑制腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移的新靶點

。

2.4.6 多藥耐藥(multidrugresistance，MDR) MDR一直是腫瘤治療的棘手問題之一

。研究證實抑癌基因Runx3的缺失和胃癌MDR相關(guān), Guo等[19]應(yīng)用siRNA敲除Runx3基因后發(fā)現(xiàn)癌細胞對多種化療藥物耐藥,將攜帶Runx3的真核生物表達載體轉(zhuǎn)染人類胃癌耐藥細胞系SGC7901,體外藥敏性分析顯示SGC?7901 對各種化療藥物敏感。進一步分析顯示Runx3可以抑制MDR?1和MDR相關(guān)蛋白1 (MRP?1)啟動子的活性, Runx3的高表達可能通過下調(diào)MDR?1

，MRP?1，Bcl?2的表達,進而使胃癌細胞對化療敏感

。另外，其中的MDR1基因的過度表達及其基因產(chǎn)物P糖蛋白增加是導(dǎo)致MDR的重要原因之一

，Nieth等[20]設(shè)計了特異的siRNA分別處理胰腺癌EPG85?257RDB細胞和胃癌EPG85?181RDB細胞來抑制MDR1的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種細胞的MDR1的mRNA和蛋白表達量可降低90%以上

，癌細胞對柔紅霉素的耐藥作用分別降低了89%和58%

。這也提示我們

，siRNA介導(dǎo)RNAi技術(shù)為克服腫瘤耐藥問題可能提供新的策略

。

2.4.7 保羅樣激酶1(Polo?like kinase 1, Plk1) Plk1是絲氨酸-蘇氨酸激酶之一

，參與了有絲分裂的不同階段。Jang等[21]檢測發(fā)現(xiàn)280例胃癌患者中Plk1表達率高達95%(268/280)

，用RNAi的方法阻斷Plk1表達后

，癌細胞的生長明顯受抑

。用siRNA敲除Plk1基因后

，細胞周期調(diào)節(jié)蛋白B的表達增加

，胃癌細胞堆積于G2/M期

，有絲分裂紡錘體形態(tài)異常

，染色體分離延遲

，胞質(zhì)分裂延遲或者停止，增殖減慢[22,23]

。另外，Plk1基因的缺失亦伴隨癌細胞凋亡的增加

，提示Plk1可能成為胃癌基因治療的理想靶點。

3 問題與展望

RNAi這一方興未艾的新技術(shù)

，為腫瘤及其他疾病的基因治療提供了新的途徑。但是仍有許多問題亟待解決：①如何在體內(nèi)實現(xiàn)靶基因RNA轉(zhuǎn)移到所有腫瘤細胞并穩(wěn)定持久地抑制癌基因表達;②如何確定21～23 nt左右的核甘酸序列作為siRNA模板的選擇原則;③如何提高載體系統(tǒng)的效率等等

?div id="jfovm50" class="index-wrap">？傊琑NAi技術(shù)作為一種研究的新工具

，治療的新手段，隨著對其機制的不斷認識和技術(shù)的改進

，必將在消化系腫瘤的研究及治療中擔任不可替代的角色

，同時也預(yù)示著后基因組時代里一個嶄新的RNA時代的到來

。

【參考文獻】

[1] Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double?stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature, 1998,391(6669): 806-811.

[2] Schwarz DS,Hutvagner G,Haley B,et al.Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways[J].Mol Cell, 2002, 10(3): 537-548.

[3] Hannon GJ.RNA interference[J].Nature,2002,418(6894):244-251.

[4] Cerutti H.RNA interference：traveling in the cell and gaining functions?[J].Trends Genet,2003,19(1):39-46.

[5] Nykanen A,Haley B,Zamore PD.ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway[J].Cell,2001,107(3):309-321.

看了?rna干擾技術(shù)論文怎么寫?的人還看：

1. rna干擾技術(shù)論文

2. rfid定位技術(shù)論文

3. smt管理技術(shù)論文

4. it技術(shù)論文

5. pcr技術(shù)論文