,精子通過(guò)交配輸入雌體,在雌體內(nèi)與卵子結(jié)合
,叫做體內(nèi)受精
。昆蟲(chóng)、爬行動(dòng)物
、鳥(niǎo)和哺乳動(dòng)物都是體內(nèi)受精的
。
具體介紹
精子和卵子融合而成受精卵的全過(guò)程稱(chēng)為受精。低等兩棲動(dòng)物多為體外受精
,而多數(shù)高等動(dòng)物行體內(nèi)受精
。體內(nèi)受精一般在輸卵管壺腹部進(jìn)行。射入陰道的精子
,靠本身的運(yùn)動(dòng)和射精后引起的子宮收縮
,被運(yùn)送到子宮,進(jìn)入輸卵管
,獲得使卵子受精的能力
,稱(chēng)為精子獲能
。排出的卵,靠輸卵管傘端汲取
、輸卵管蠕動(dòng)及其上皮細(xì)胞纖毛擺動(dòng)
,被運(yùn)送到壺腹部。與卵子接近的精子僅200個(gè)左右
,當(dāng)精子與卵子即將接觸的一瞬間
,精子頂體中的酶系便釋放出來(lái),協(xié)助精子穿透卵子外各層
。卵子也分泌活精肽
,幫助精子進(jìn)入卵內(nèi)。一個(gè)精子進(jìn)入后
,卵子立即產(chǎn)生抑制頂體素的物質(zhì)
,封鎖透明帶
,使其他精子不再進(jìn)入
;同時(shí)觸發(fā)減數(shù)第二分裂的最后一步,放出第二極體
。卵細(xì)胞核形成雌性原核
,卵內(nèi)精子染色質(zhì)形成雄性原核。隨即兩性原核融合
,形成受精卵
。
體外受精
體外受精(In Vitro Fertilization)或(external fertilization)是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過(guò)程的技術(shù),英文簡(jiǎn)稱(chēng)為IVF
。由于它與胚胎移植技術(shù)(ET)密不可分
,又簡(jiǎn)稱(chēng)為IVF-ET。在生物學(xué)中
,把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動(dòng)物稱(chēng)試管動(dòng)物(test-tube animal)
。這項(xiàng)技術(shù)成功于20世紀(jì)50年代,在最近20年發(fā)展迅速
,現(xiàn)已日趨成熟而成為一項(xiàng)重要而常規(guī)的動(dòng)物繁殖生物技術(shù)
。
體外受精技術(shù)對(duì)動(dòng)物生殖機(jī)理研究、畜牧生產(chǎn)
、醫(yī)學(xué)和瀕危動(dòng)物保護(hù)等具有重要意義
。如用小鼠、大鼠或家兔等作實(shí)驗(yàn)材料
,體外受精技術(shù)可用于研究哺乳動(dòng)物配子發(fā)生
、受精和胚胎早期發(fā)育機(jī)理。在家畜品種改良中
,體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價(jià)而高效的手段
,對(duì)充分利用優(yōu)良品種資源
,縮短家畜繁殖周期,加快品種改良速度等有重要價(jià)值
。在人類(lèi)
,IVF-ET技術(shù)是治療某些不孕癥和克服性連鎖病的重要措施之一。體外受精技術(shù)還是哺乳動(dòng)物胚胎移植
、克隆
、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分。
一
、體外受精技術(shù)的發(fā)展簡(jiǎn)史
早在1878年
,德國(guó)人Scnenk就以家兔和豚鼠為材料,開(kāi)始探索哺乳動(dòng)物的體外受精技術(shù)
,但一直沒(méi)有獲得成功
。直到1951年,美籍華人張明覺(jué)和澳大利亞人Austin同時(shí)發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的精子獲能現(xiàn)象
,這一領(lǐng)域的研究才獲得突破性進(jìn)展
。 1959年,張明覺(jué)以家兔為實(shí)驗(yàn)材料
,從一只交配后12h的母兔子宮中沖取精子(即體內(nèi)獲能的精子)
,從另外兩只超數(shù)排卵處理母兔的輸卵管中收集卵子,精子和卵子在體外人工配制的溶液中完成受精過(guò)程
,然后
,正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受體的輸卵管中,其中4只妊娠
,并產(chǎn)下15只健康仔兔
,這是世界上首批試管動(dòng)物,它們的正常發(fā)育標(biāo)志著體外受精技術(shù)的建立
。
20世紀(jì)60年代初至20世紀(jì)80年代中期
,人們以家兔、小鼠和大鼠等為實(shí)驗(yàn)材料
,進(jìn)行了大量基礎(chǔ)研究
,在精子獲能機(jī)理和獲能方法方面取得很大進(jìn)展。精子由最初在同種或異種雌性生殖道孵育獲能
,發(fā)展到用子宮液
、卵泡液、子宮內(nèi)膜提取液或血清等在體外培養(yǎng)獲能
,最后用化學(xué)成分明確的溶液培養(yǎng)獲能
。同時(shí),通過(guò)射出精子和附睪精子獲能效果的比較研究
,人們發(fā)現(xiàn)射出精液中含有去能因子
,并認(rèn)識(shí)到獲能的實(shí)質(zhì)是去除精子表面的去能因子
。這些理論和方法上的成就,推動(dòng)了體外受精技術(shù)的發(fā)展
,試管小鼠(Whit-tingham
,1968)、大鼠(Toyoda和Chang
,1974)
、嬰兒(Steptoe和Edwards,1978)
、牛(Brackett等
,1982)、山羊(Hamda
,1985)
、綿羊(Hanada,1985)和豬(Chang等
,1986)等相繼出生
。
20世紀(jì)80年代中期以后,以牛為代表的家畜IVF技術(shù)發(fā)展迅速
,1986年P(guān)arrish等用含肝素的介質(zhì)處理牛的冷凍精液
,然后與體外成熟的卵母細(xì)胞體外受精獲得成功
。這對(duì)牛IVF的研究和應(yīng)用具有重要意義
,因?yàn)檫@種方法可利用屠宰場(chǎng)廢棄的卵巢和冷凍精液進(jìn)行胚胎體外生產(chǎn),不僅成本低廉
,而且效果穩(wěn)定
。此后,牛的卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎培養(yǎng)體系逐步趨于成熟
,胚胎體外生產(chǎn)效率得到很大提高
。目前,采用IVF-ET技術(shù)
,每對(duì)廢棄的牛卵巢可獲得3頭左右的犢牛
。為充分利用良種母牛的遺傳資源,20世紀(jì)80年代后期
,牛的活體取卵技術(shù)(Ovum pick UP.OPU)發(fā)展迅速
。活體取卵和IVF-ET結(jié)合已成為歐
、美和大洋洲等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家的農(nóng)場(chǎng)主為擴(kuò)大良種母牛群選擇的重要繁殖技術(shù)
。
牛的體外受精技術(shù)不僅應(yīng)用于畜牧生產(chǎn),同時(shí)
,也成為研究其他胚胎生物技術(shù)
,如克隆
、轉(zhuǎn)基因、胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)和性別控制等的重要輔助手段
。
二
、體外受精技術(shù)的基本操作程序
哺乳動(dòng)物體外受精的基本操作程序,主要環(huán)節(jié)包括以下幾個(gè)方面:
(一)卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)
1.卵母細(xì)胞的采集:卵母細(xì)胞的采集方法通常有三種
。
(1)超數(shù)排卵:雌性動(dòng)物用促卵泡素和促黃體素處理后
,從輸卵管中沖取成熟卵子可直接與獲能精子受精。在大家畜中
,由于操作程序復(fù)雜
,成本較高,很少使用
。這種方法的關(guān)鍵是掌握卵子進(jìn)入輸卵管和卵子在輸卵管中維持受精能力的時(shí)間
,一般要求在卵子具有旺盛受精力之前沖取。
(2)從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞 :這種方法是借助超聲波探測(cè)儀
、內(nèi)窺鏡或腹腔鏡直接從活體動(dòng)物的卵巢中吸取卵母細(xì)胞
。
在家畜中, 牛和馬等大家畜常用超聲波探測(cè)儀輔助取卵
,其方法是用手從直腸把握卵巢
,經(jīng)陰道壁穿刺插入吸卵針,借助B型超聲波圖像引導(dǎo)
,吸取大卵泡中的卵母細(xì)胞
。按照目前的技術(shù)水平,一頭健康母牛每周可獲得5~10枚卵子
。在家畜中
,活體采集的卵母細(xì)胞一般要經(jīng)成熟培養(yǎng)后才能與精子受精。這種方法對(duì)擴(kuò)繁優(yōu)良母畜具有重大意義
,在有些國(guó)家已用于商業(yè)化生產(chǎn)
。
(3)從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞:這種方法是從剛屠宰母畜體內(nèi)摘出卵巢,經(jīng)洗滌
、保溫(30℃~37℃)后
,快速運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室,在無(wú)菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細(xì)胞(牛卵泡直徑要求3-10mm)也可對(duì)卵巢進(jìn)行切片
,收集卵母細(xì)胞
。用此方法獲得的卵母細(xì)胞多數(shù)處于生發(fā)泡期(GV期),需要在體外培養(yǎng)成熟后才能與精子受精
。從廢棄卵巢中采集卵母細(xì)胞的關(guān)鍵是注意卵巢的保溫和防止細(xì)菌污染
。因此卵巢從畜體摘取后須放入含有生理鹽水或磷酸緩沖液(PBS)的保溫瓶中;吸卵前卵巢要用生理鹽水或PBS多次洗滌;所用溶液都要添加抗生素
。
這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是材料來(lái)源豐富
,成本低廉,但確定母畜的系譜困難
。
2.母細(xì)胞的選擇:采集的卵母細(xì)胞絕大部分與卵丘細(xì)胞形成卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complesx COC)
。無(wú)論采用何種方法,采集的COC都要求卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則
,細(xì)胞質(zhì)均勻
,外圍有多層卵丘細(xì)胞緊密包圍。在家畜體外受精研究中
,常把未成熟卵母細(xì)胞分為A
、B、C和D四個(gè)等級(jí)
。A級(jí)卵母細(xì)胞要求有三層以上卵丘細(xì)胞緊密包圍
,細(xì)胞質(zhì)均勻;B級(jí)要求卵母細(xì)胞質(zhì)均勻
,卵丘細(xì)胞層低于三層或部分包圍卵母細(xì)胞
;C級(jí)為沒(méi)有卵丘細(xì)胞包圍的裸露卵母細(xì)胞;D級(jí)是死亡或退化的卵母細(xì)胞
。在體外受精實(shí)踐中
,一般只培養(yǎng)A級(jí)和B級(jí)卵母細(xì)胞。
3.卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng):由超數(shù)排卵采集的卵母細(xì)胞已在體內(nèi)發(fā)育成熟
,不需培養(yǎng)可直接與精子受精
,對(duì)未成熟卵母細(xì)胞需要在體外培養(yǎng)成熟。培養(yǎng)時(shí)
,先將采集的卵母細(xì)胞在實(shí)體顯微鏡經(jīng)過(guò)挑選和洗滌后
,然后放入成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)
。家畜卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清
、促性腺激素、雌激素和抗生素成份
。通常采用微滴培養(yǎng)法
,微滴體積為50-200微升,每滴中放入的卵母細(xì)胞數(shù)按每5微升一個(gè)計(jì)算單位
。卵母細(xì)胞移入小滴后
,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為39℃
、100%濕度和5%二氧化碳的空氣
。牛的培養(yǎng)時(shí)間為20-24小時(shí),卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體經(jīng)成熟培養(yǎng)后,卵丘細(xì)胞層擴(kuò)散靠近卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞呈放射狀排列
,出現(xiàn)放射冠
,用DNA特意性染料染色后,在顯微鏡下進(jìn)行核相觀察
,可見(jiàn)卵母細(xì)胞處于第2次成熟分裂中期
。
(二)體外受精
1.精子的獲能處理:哺乳動(dòng)物精子的獲能方法有培養(yǎng)和化學(xué)誘導(dǎo)兩種方法。牛
、羊的精子常用化學(xué)藥物誘導(dǎo)獲能
,誘導(dǎo)獲能的藥物常用肝素和鈣離子載體。
2.受精:即獲能精子與成熟卵子的共培養(yǎng)
,除鈣離子載體誘導(dǎo)獲能外
,精子和卵子一般在獲能液中完成受精過(guò)程。受精培養(yǎng)時(shí)間與獲能方法有關(guān)
。在B2液中一般為6-8小時(shí)而用TALP或S.F液作受精液時(shí)可培養(yǎng)18~24h
。精子和卵子常在小滴中共培養(yǎng),受精時(shí)精子密度為1~9×10 6/ml
,每10微升精液中放人1~2枚卵子
,小滴體積一般為50~200微升。
(三)胚胎培養(yǎng)
精子和卵子受精后
,受精卵需移入發(fā)育培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)以檢查受精狀況和受精卵的發(fā)育潛力
,質(zhì)量較好的胚胎可移入受體母畜的生殖道內(nèi)繼續(xù)發(fā)育成熟或進(jìn)行冷凍保存。
提高受精卵發(fā)育率的關(guān)鍵因素是選擇理想的培養(yǎng)體系
。在家畜中
,胚胎培養(yǎng)液分為復(fù)雜的和化學(xué)成分明確的培養(yǎng)液兩大類(lèi)。復(fù)雜培養(yǎng)液中的成分很多
,除無(wú)機(jī)和有機(jī)鹽外
,還添加維生素、氨基酸
、核苷酸和嘌呤等營(yíng)養(yǎng)成分和血清
,最常用的有TCM199、B2和F10
。用它們培養(yǎng)胚胎時(shí)
,可以采用體細(xì)胞共培養(yǎng)體系,即體細(xì)胞與胚胎在微滴中共同培養(yǎng)
,利用體細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的有益因子
,促進(jìn)胚胎發(fā)育,克服發(fā)育阻斷
。
受精卵的培養(yǎng)廣泛采用微滴法
,胚胎與培養(yǎng)液的比例為一枚胚胎用3~10微升培養(yǎng)液;一般5~10枚胚胎放在一個(gè)小滴中培養(yǎng)以利用胚胎在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的活性因子,相互促進(jìn)發(fā)育
。胚胎培養(yǎng)條件與卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)條件相同
。有的實(shí)驗(yàn)室采用88% N2、7% O2和5%二氧化碳混合氣體培養(yǎng)
,以降低培養(yǎng)液中氧自由基濃度
,提高胚胎發(fā)育率。胚胎在培養(yǎng)過(guò)程中要求每48-72小時(shí)更換一次培養(yǎng)液
,同時(shí)觀察胚胎的發(fā)育狀況
。當(dāng)胚胎發(fā)育到一定階段時(shí)可進(jìn)行胚胎移植或冷凍保存,牛
、羊受精卵通常培養(yǎng)到致密桑椹胚或囊胚時(shí)進(jìn)行移植或冷凍保存
。
三、家畜體外受精技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀和存在的問(wèn)題
(一)發(fā)展現(xiàn)狀:家畜體外受精技術(shù)經(jīng)過(guò)近20年的發(fā)展
,已取得很大進(jìn)展
,其中牛的IVF水平最高,入孵卵母細(xì)胞(即進(jìn)入成熟培養(yǎng))的卵裂率為80%~90%
,受精后第七天的囊胚發(fā)育率為40%~50%
,囊胚超低溫冷凍后繼續(xù)發(fā)育率為80%,移植后的產(chǎn)犢率為30%~40%.平均每個(gè)卵巢可獲得A級(jí)卵母細(xì)胞10個(gè)左右
,經(jīng)體外受精可獲得3~4個(gè)囊胚
,移植后產(chǎn)犢1~2頭。
(二)存在的問(wèn)題和發(fā)展方向
1.存在的問(wèn)題
(1)囊胚發(fā)育率低
,細(xì)胞數(shù)少
。體外受精卵在培養(yǎng)過(guò)程中普遍存在發(fā)育阻斷(developmental
block),即胚胎發(fā)育到一定階段后停止發(fā)育并發(fā)生退化的現(xiàn)象
。牛胚胎阻斷發(fā)生在8~16細(xì)胞階段
,這就導(dǎo)致體外受精卵的囊胚發(fā)育率遠(yuǎn)低于體內(nèi)受精。此外
,與體內(nèi)受精囊胚相比
,體外受精囊胚的細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)明顯減少。
(2)產(chǎn)犢率低
,胎兒初生重高
。家畜體外受精胚胎,特別是牛的IVF胚胎移人受體后
,產(chǎn)犢率比體內(nèi)受精低15%~20%,但胎兒初生重比人工授精后代高3~4kg
,導(dǎo)致受體母畜難產(chǎn)率高
。
2.發(fā)展方向
(1)深入研究卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育的分子機(jī)理 體外受精效率低的主要原因是人
們對(duì)卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育的分子機(jī)理了解不夠。大幅度提高IVF效率的前提是探明卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理,然后以此理論為指導(dǎo)
,研究理想的培養(yǎng)體系
,促使胚胎基因組得到穩(wěn)定、有序表達(dá).
(2)加強(qiáng)腔前卵泡培養(yǎng)的研究
,利用優(yōu)良母畜的遺傳資源 目前IVF技術(shù)利用的卵母細(xì)胞不足家畜卵巢上卵母細(xì)胞總數(shù)的千分之一
。為此,一方面提高活體取卵技術(shù)
,另一方面需研究腔前卵泡和小卵泡的體外成熟技術(shù)
。為保證卵母細(xì)胞的穩(wěn)定來(lái)源及良種母畜或?yàn)l危動(dòng)物的保種,卵泡和卵母細(xì)胞的超低溫冷凍保存技術(shù)的研究也必須加強(qiáng)
。
(3)加強(qiáng)體外受精與其他生物技術(shù)的結(jié)合
。體外受精與轉(zhuǎn)基因、克隆
、性別控制及胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)密不可分