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2016年09月06日訊 過去10年里誕生了兩種非常有用的生物學(xué)工具，第一個就是人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs），這是一項榮獲諾貝爾獎的先進(jìn)科技產(chǎn)物
第二項工具就是CRISPR-Cas9系統(tǒng)
！如何利用CRISPR技術(shù)編輯人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞.png" />
上述兩種技術(shù)的結(jié)合或?qū)聿豢晒懒康男?yīng)，利用CRISPR編輯的iPSCs可以使得科學(xué)家對基因進(jìn)行操作來研究在特殊疾病背景下的基因功能
盡管CRISPR-Cas9和人類iPSCs已經(jīng)成為研究者在實驗室中老生常談的話題了
最基本的工作流程
編輯且控制人類iPSCs細(xì)胞中的基因表達(dá)往往以兩條平行的工作流開始，首先就是保證多能細(xì)胞的可靠來源
人類多能干細(xì)胞VS人類腫瘤細(xì)胞系
首先研究者在人類癌細(xì)胞系中嘗試CRISPR-Cas9工具
開始了解我們的基因
研究者表示，我們應(yīng)當(dāng)研究基因位點并且理解這些序列的功能
選擇多種導(dǎo)向RNAs并且對其進(jìn)行檢測，如今大量的軟件都能夠選擇導(dǎo)向RNAs，但我們要記住
敲除VS精確編輯
當(dāng)利用CRISPR-Cas9切割基因時
目前研究者Hockemeyer及其同事正在開發(fā)新型策略來使得同源性直接修復(fù)發(fā)揮主要作用
研究者Conklin的團隊開發(fā)出了一種快速的數(shù)字PCR技術(shù)，其能夠?qū)DR和NHEJ的修復(fù)率進(jìn)行定量
對切割進(jìn)行特性描述
在細(xì)胞分化前和分化后
此外研究者還抽取了基因編輯的基因組進(jìn)行調(diào)查，比如利用這些區(qū)域的PCR和Sanger測序結(jié)果等
脫靶效應(yīng)
一種抑制脫靶編輯的主要方法就是至少利用兩種或多種靶向作用相同位點的不同“向?qū)А?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">，而這或許并不可能給出相同的脫靶結(jié)果
；一般而言，脫靶效應(yīng)并不是主要的問題所在，至少對于大多數(shù)基礎(chǔ)科學(xué)家而言是這樣的，相比癌細(xì)胞系而言，脫靶效應(yīng)往往并不太可能發(fā)生于人類的多能干細(xì)胞中，但研究者如果真得非常關(guān)心的話，進(jìn)行全外顯子組測序或許就是最佳的方法了。控制基因的表達(dá)而不是對基因進(jìn)行編輯
如果希望對多能干細(xì)胞中對多能性表現(xiàn)非常重要的基因進(jìn)行敲除的話
，很明顯我們的運氣并不夠好，我們或許并不能用死細(xì)胞得出太多信息，在這種情況下，我們就需要提高或減弱基因的表達(dá)，而擴大CRISPR-Cas9工具的功能或許就能達(dá)到這種目的；研究者們通常會使用一種“死亡版本”的Cas9，其能夠結(jié)合到基因組中的預(yù)定位置但并不會切割DNA序列，相反，死亡版本”Cas9的不同突變體要么會抑制轉(zhuǎn)錄（稱之為CRISPR干擾，CRISPRi），要么會激活表達(dá)。近來一項研究發(fā)現(xiàn)
，對ipsCs篩查尋找功能缺失區(qū)域時，相比CRISPR-Cas9而言，CRISPRi或許會比傳統(tǒng)的CRISPR更加有效基因表達(dá)控制和基因編輯之間的主要差異就是
對于研究者而言，將CRISPRi和CRISPRa有效成功地運輸?shù)饺祟惗嗄芨杉?xì)胞中非常復(fù)雜
，研究者Cowen指出，目前除非使用病毒載體的運輸方法，否則仍然很難將CRISPRi和CRISPRa運輸?shù)?0%至80%的細(xì)胞中，而目前我們僅僅談?wù)摰氖?0%至40%的細(xì)胞，研究者認(rèn)為這或許能給他們帶來一定幫助，因為在某些情況下他們很難或者不可能將ipsC分化成為特殊類型的細(xì)胞，研究者Cowen長期利用CRISPRa來激活并且驗證報道基因，他表示，在我們實驗室利用腎臟內(nèi)皮細(xì)胞就能夠知道報道基因是否在正常工作。根據(jù)新聞報道
，第一項測試人體內(nèi)基因編輯技術(shù)CRISPR的研究即將在美國展開。根據(jù)美聯(lián)社報道
，該研究計劃使用CRISPR治療導(dǎo)致失明的遺傳性眼部疾病。的人這種情況有一個基因突變，影響視網(wǎng)膜的功能
，視網(wǎng)膜是眼睛后部的感光細(xì)胞，對正常視力至關(guān)重要。這種情況是Leber先天性黑蒙的一種形式，據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院稱，兒童失明最常見的原因之一，每10萬名新生兒中就有2至3名會受到影響。
這種治療方法將使用CRISPR來糾正突變
，CRISPR是一種讓研究人員能夠精確編輯DNA的工具美聯(lián)社報道，在一個特定的地點，
的研究人員將使用一種注射劑將治療直接傳遞到感光細(xì)胞
，根據(jù)Editas Medicine公司的一份聲明，Editas Medicine公司正在與Allergan一起進(jìn)行這項研究這項試驗將總共招收18名患者
這項新研究不同于中國科學(xué)家去年用CRISPR編輯雙胞胎嬰兒基因組的有爭議的研究
科學(xué)家們剛剛用CRISPR解開人類基因組做了10件令人驚奇的事情：仿生人類的6個分子里程碑：最初發(fā)表在《生命科學(xué)》上的十大技術(shù) 。
簡述crisprcas9的原理和用途如下：
CRISPR-Cas9技術(shù)原理：CRISPR-Cas9技術(shù)包含兩種重要的組分
，一種是行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白，而另一種則是具有導(dǎo)向功能的gRNA。CRISPR-Cas9技術(shù)利用一段與靶序列互補的gRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶對特異靶向DNA進(jìn)行識別和切割，造成DNA的雙鏈或單鏈斷裂，然后，細(xì)胞會利用自身具備的兩種DNA修復(fù)機制對斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)，即非同源性末端接合或同源介導(dǎo)的修復(fù)。CRISPR-Cas9用途：利用兩種修復(fù)機制，可以實現(xiàn)基因的插入和敲除
。沒有模板的情況下，利用NHEJ修復(fù)，隨機插入或缺失序列造成基因敲除。有模板存在的情況下，可通過HDR修復(fù)在剪切位點引入目的修飾基因，實現(xiàn)基因的定點修改。
主要功能
CRISPR-Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御
，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，則是對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，這項技術(shù)也是用于基因編輯中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)在一系列基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域都展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景
，例如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病。該技術(shù)成果已應(yīng)用于人類細(xì)胞
專利授權(quán)
2014年4月15日
CRISPR Cas9 -- C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats CRISPR- A ssociated P roteins 9
Crispr-CAS9系統(tǒng)最初在細(xì)菌和古生菌中觀察到，作為一種適應(yīng)性微生物免疫系統(tǒng)
入侵的外來DNA被Cas核酸酶切割，然后以間隔序列的形式被保守的重復(fù)序列捕獲并整合到crispr位點
文獻(xiàn)中已描述45個不同的cas蛋白家族
內(nèi)切酶是化膿性鏈球菌產(chǎn)生的細(xì)菌CAS9核酸酶蛋白。CAS9核酸酶具有兩個DNA剪切結(jié)構(gòu)域（Ruvc1和HNH-like核酸酶域）
，可剪切雙鏈DNA使雙鏈斷裂（DSBgRNA是一種工程化的單鏈嵌合體RNA
NHEJ修復(fù)路徑是一種容易出錯的修復(fù)機制
除NHEJ
CRISPR-CAS9系統(tǒng)可以通過gRNA的設(shè)計針對任何基因組區(qū)域的特異性取決于位于目標(biāo)序列下游的PAM序列
PAM識別序列因來源于CAS9核酸酶的細(xì)菌種類和類型而異。最常用的II型CRISPR系統(tǒng)使用來自化膿性鏈球菌的CAS9核酸酶
Table 1 : PAM Sequences from Different Species and Subtypes of Cas Nucleases.
Cas9 Nickase是Cas9的一種突變形式
為了利用Cas9 Nickase進(jìn)行基因組編輯
如果共同引入含有所需修飾的修復(fù)模板DNA與gRNA和Cas9 nickase，則Cas9 Nickase也可用于通過同源重組產(chǎn)生核苷酸修飾
Table 2 : Cas9 Nickase and Nuclease Usage in Gene Disruption and Specific Gene Modification
Cas9雙突變體或Null突變體是通過突變野生型Cas9的兩個切割結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生的
Table 3 : Comparison of spCas9, saCas9, and Cpf1 nucleases
large size and G-rich PAM sequence
Cpf1于2015年底由麻省理工學(xué)院的Feng Zhang小組發(fā)現(xiàn)
。在16種候選Cpf1蛋白中，兩種在哺乳動物細(xì)胞中最具潛力的高特異性基因組編輯工具：asCpf1和lb2Cpf1。這些核酸酶在人類細(xì)胞中具有與常用spCas9相當(dāng)?shù)陌邢蚯懈钚省?/p>Cpf1允許新的定位可能性
，因為它識別富含T的PAM位點。與Cas9的富含G的PAM要求相比，這顯著擴大了可能的基因組目標(biāo)的范圍。雖然Cas9可能是靶向富含G的區(qū)域的優(yōu)選核酸酶Cpf1需要較短的guide RNA才能運作。雖然Cas9需要tracrRNA的存在來處理crRNA
另一個顯著差異是Cas9在切割后產(chǎn)生平端，而Cpf1留下可用于定向克隆的粘性5'突出端
Cpf1切割PAM位點下游18-23bp的DNA
，導(dǎo)致NHEJ修復(fù)雙鏈DNA斷裂后對識別序列沒有破壞。導(dǎo)致Cpf1能夠進(jìn)行多輪DNA切割，并且增加了進(jìn)行所需基因組編輯的機會。相比之下，由于Cas9僅在PAM位點上游切割3bp，因此NHEJ途徑導(dǎo)致indel突變，其破壞識別序列，從而防止進(jìn)一步的切割輪次。理論上，重復(fù)的DNA切割輪次應(yīng)該導(dǎo)致Cpf1導(dǎo)致靶基因的沉默增加，并且在敲入實驗的情況下，發(fā)生同源定向修復(fù)的機會更大。雖然化膿性鏈球菌Cas9（S. pyogenes Cas9; spCas9）是最常用的CRISPR核酸酶，但最近的注意力已轉(zhuǎn)向從金黃色葡萄球菌中分離的微型Cas9核酸酶（S. aureus; saCas9）
。這種小核酸酶通過使生物體內(nèi)基于CRISPR的基因編輯更加可行，具有改變生物醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)業(yè)的巨大潛力。 SaCas9和spCas9能夠以相當(dāng)?shù)男试隗w內(nèi)切割真核DNA。但saCas9具有幾個特性，使其對某些應(yīng)用更有用。SaCas9比spCas9小約1kb，使其能夠更有效地包裝到較小容量的腺相關(guān)病毒（AAV）中
同樣
，與spCas9相比，saCas9為基因組編輯開辟了新的可能性，因為它具有不同的定位能力。 spCas9識別5'-NGG-3'的PAM序列，而saCas9識別5'-NNGRRT-3'?div id="d48novz" class="flower left">saCas9較長的PAM的一個缺點是
，該序列在基因組中的發(fā)生頻率低于spCas9的PAM序列，限制了其潛在的效用。 然而，saCas9較長的PAM序列應(yīng)該有助于防止脫靶的切割，因為它具有更高的特異性。麻省理工學(xué)院張實驗室于2015年進(jìn)行的一項研究調(diào)查了體內(nèi)saCas9的表現(xiàn)
。 他們將攜帶saCas9的AAV注射到小鼠體內(nèi)以破壞PCSK9基因，該基因與家族性高膽固醇血癥有關(guān)。 這導(dǎo)致1周后肝組織中基因修飾> 40％，注射后4周沒有毒性跡象。 最近的其他工作已經(jīng)用于開發(fā)具有使用分子進(jìn)化的松弛PAM識別特異性的變體saCas9。 與野生型saCas9相比，這種變體允許更大范圍的潛在編輯目標(biāo)，同時保留其小尺寸傳達(dá)的優(yōu)勢。 鋅指核酸酶（Zinc-finger Nucleases; ZFNs）
轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases; TALENs）
Table 4 : Comparison of current genome editing technologies
An Intro to CRISPR Cas9
6月11日
，頂級學(xué)術(shù)期刊《自然》（Nature）子刊《自然-醫(yī)學(xué)》（Nature Medicine） 同時發(fā)表了兩篇新成果，給持續(xù)受到追捧的“基因魔剪” CRISPR技術(shù)潑了冷水。來自瑞典卡洛林斯卡研究所和劍橋諾華生物醫(yī)學(xué)研究院的兩個研究團隊分別將關(guān)注點投到了一處：CRISPR編輯成功或增加患癌風(fēng)險。
兩個團隊認(rèn)為，CRISPR/Cas9基因編輯過程中造成的DNA雙鏈斷裂
，會激活p53蛋白通路，引起人多能干細(xì)胞的凋亡。反過來也就是說
p53缺陷是至今已知的與癌癥相關(guān)的最普遍的基因突變
CRISPR技術(shù)的安全性再次受到質(zhì)疑后，首當(dāng)其沖的是幾家基因編輯領(lǐng)域內(nèi)的公司
增加患癌風(fēng)險
此前的研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9技術(shù)運用到人多能干細(xì)胞（hPSC）時
CRISPR Therapeutics首席執(zhí)行官Sam Kulkarni此番也表示，該研究結(jié)果看起來是有道理的
來源：澎湃新聞網(wǎng)
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