，一種傾向性的觀點是認(rèn)為單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物幾乎不可能或沒有可能性
。這種觀點的代表人物是曾在小麥等禾谷類作物組織培養(yǎng)與基因槍轉(zhuǎn)導(dǎo)方面卓有建樹的瑞士科學(xué)家Potrykus
，他在國際權(quán)威雜志“Bio/Technology”和“Nature”都發(fā)表了他的悲觀論點。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的石刁柏轉(zhuǎn)基因植株的獲得
，特別是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因玉米的獲得
，不僅改變了單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主的看法，而且證明農(nóng)桿菌介導(dǎo)法完全可以用于禾谷類作物的遺傳轉(zhuǎn)化
。
在小麥上
，雖然有人早在1988年就證明農(nóng)桿菌能侵染并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，隨后又有人證明農(nóng)桿菌能附著到經(jīng)部分酶解和未酶解的小麥幼胚細(xì)胞
，但多年來一直沒有得到轉(zhuǎn)基因植株
。Hess等報道，直接將農(nóng)桿菌接種到小穗獲得具有抗生素性和經(jīng)Southern Blot雜交證明的轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株
，外源基因部分在F1和F2中卻未能檢測到外源基因的存在。在人工授粉后再用攜帶有共合載體（pCV2260和pSIR42）的農(nóng)桿菌（株系C158）處理雌蕊
，Pukhal’skii獲得經(jīng)過PCR和Southern Blot雜交證明的F1植株
，并由此獲得具有外源基因的F2植株。這種簡單的基因轉(zhuǎn)化方法
，結(jié)合了花粉通道與農(nóng)桿菌侵染的優(yōu)勢
，如果能夠被其它實驗室所證實，將在小麥等的基因轉(zhuǎn)化上發(fā)揮主導(dǎo)作用
。
在農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方面
，Cheng等于1997打破了十幾年的沉默，首次獲得的正常的轉(zhuǎn)基因小麥植株
。2年后
，我國科學(xué)工作者夏光敏等報道獲得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小麥植株
，筆者的研究組也同樣成功地獲得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小麥植株(待發(fā)表)。這種成功意味著
，小麥也能象雙子葉植物一樣享受農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的所有優(yōu)點
。
結(jié)合農(nóng)桿菌介導(dǎo)與基因槍法的“Agrolistic”法，或通過微彈造成的微孔來幫助農(nóng)桿菌附著及其所含質(zhì)粒向受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移
，或把分別攜帶有 VirDl
、VirD2和T-DNA的邊界序列加外源片段的三個質(zhì)粒導(dǎo)入受體，通過VirDl和VirD2在受體中的正常表達(dá)促使外源目標(biāo)片段采用T-DNA邊界序列以較低的拷貝數(shù)插入受體的基因組中
，已經(jīng)在小麥的基因轉(zhuǎn)化上嶄露頭角
。超聲波輔助的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation ，SAAT)通過超聲波在受體細(xì)胞上產(chǎn)生的微孔來幫助農(nóng)桿菌附著及其所含質(zhì)粒向受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移
，使外源基因在小麥?zhǔn)荏w細(xì)胞的瞬時表達(dá)強(qiáng)度相對純農(nóng)桿菌法增加至少100倍
。Singh和Chawla和Serik等還利用碳化硅纖維(silicon carbide fibeers)來輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因。此外
，還有結(jié)合農(nóng)桿菌與病毒的“Agroinfection ”法等
。這些方法目前雖然還不成熟，但在小麥基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有很大的潛力
。
2
、小麥基因轉(zhuǎn)化的受體
作為基因轉(zhuǎn)化的受體取決于所用的轉(zhuǎn)基因方法，而受體操作的難易程度又決定了轉(zhuǎn)基因方法的成敗
。
小麥胚性懸浮細(xì)胞及其分離出的原生質(zhì)體多用作電激法
、PEG法和顯微注射法等直接轉(zhuǎn)基因法的受體。正是由于原生質(zhì)體和懸浮細(xì)胞再生植株的困難
，使電激法等直接法在小麥的基因轉(zhuǎn)化方面沒有多少“用武之地”
。小麥的胚性愈傷組織，特別是幼胚及其愈傷組織和幼胚盾片及其愈傷組織具有較強(qiáng)的植株再生能力 (有人認(rèn)為它們具有較大比例的全能性細(xì)胞)
，無論作為基因槍法的受體還是作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的受體都能再生出轉(zhuǎn)基因植株
，從而成為迄今為止小麥基因轉(zhuǎn)化的主要受體，同時也使基因槍法成為目前小麥的主要轉(zhuǎn)基因方法
，也有可能使農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成為今后小麥基因轉(zhuǎn)化的主要方法
。筆者研究組近年的實驗結(jié)果 (待發(fā)表)表明，小麥花藥愈傷組織的再生能力很強(qiáng)
，經(jīng)基因槍轟擊后比較容易獲得轉(zhuǎn)基因植株
，因而也是小麥轉(zhuǎn)基因的良好受體。小麥的各種分生組織作為“手持式”基因槍的受體具有較大的利用潛力
，但這一潛力的發(fā)揮還有待這種基因槍本身的完善和經(jīng)濟(jì)可利用性
。雌蕊，作為花粉管通道法及農(nóng)桿菌一花粉通道法的唯一受體
，隨著這些轉(zhuǎn)基因方法的完善將在小麥轉(zhuǎn)基因方面發(fā)揮越來越重要的作用
，有可能發(fā)揮主導(dǎo)作用
。小孢子、花粉
、大孢子和葉基作為小麥轉(zhuǎn)基因的受體可能得到進(jìn)一步的開發(fā)
，但在不久的將來，不可能成為主要受體
。幼穗可能是進(jìn)行小麥基因轉(zhuǎn)化一個很好的受體
。陳梁鴻在比較幼穗和幼胚為受體的轉(zhuǎn)化試驗中觀察到，幼穗的轉(zhuǎn)化效果優(yōu)于幼胚
。
3
、小麥基因轉(zhuǎn)化的目標(biāo)基因和選擇
標(biāo)志基因到目前為止，在雙子葉植物基因轉(zhuǎn)化中常用的選擇基因和報告基因仍然多作為小麥遺傳轉(zhuǎn)化的目標(biāo)基因兼選擇基因
，這些基因主要有報告基因類的GUS
、CAT和LUC;抗抗生素類的NptII、Hpt和抗除草劑類的Bar
、EPSPs
、Bxn、CP4和GOX
。這些基因在小麥上利用主要是為了建立有效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)
。隨著小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和完善，旨在改良小麥性狀的真正的目標(biāo)基因的利用不斷增多
。迄今為止
，已經(jīng)導(dǎo)入小麥并在轉(zhuǎn)基因植株中得到表達(dá)的目標(biāo)基因主要有：①改良小麥加工品質(zhì)方面的基因：高分子量谷蛋白亞基(HMW Glutenin subunit)基因lAxl、lDx5和lDxl0和重組高分子量谷蛋白亞基基因
。②抗病基因：病毒外殼蛋白基因(Coat protein genes
，CP)、類萌芽素蛋白(germin-like proteins
，GLPs)基因
、水稻thaumatin-like 蛋白基因TLP、藜蘆醇合成酶(stilbene synthase )基因
、大麥種子核糖滯活蛋白（ribosom-inactivating protein
，RIP）基因和玉米Ds轉(zhuǎn)座子; ③嵌合雄性不育類基因：核糖核酸酶類基因Barnase、細(xì)胞骨架蛋白基因等;④抗除草劑類基因：Bar
、EPSPs
、Bxn
、CP4和GOX
。
在雙子葉植物上廣泛作為選擇基因的抗抗生素類基因，如NptII和Hpt等
，在小麥轉(zhuǎn)基因上應(yīng)用較少
。其主要原因有兩個:第一是小麥對Kan具有較高的天然抗性
，第二是,人們對小麥含抗生素基因的安全性的憂慮。到目前為止
，在轉(zhuǎn)基因小麥中應(yīng)用得最多的選擇基因是抗除草劑基因Bar
。
報告基因GUS、CAT和LUC曾為小麥基因轉(zhuǎn)化體系的建立作出重大貢獻(xiàn)
。但在小麥轉(zhuǎn)基因體系基本成熟的今天
，人們已經(jīng)開始尋求其它的基因以代替上述單純的報告基因或者根本不再利用報告基因。值得一提的是外觀可見報告基因(visual marker)
。McCormac等和Mentewab等用花色素苷生物合成促進(jìn)基因(anthocyanin biosynthesis stimulatory genes)
，如Cl/Lc，作為報告基因
，通過對轉(zhuǎn)化受體及其細(xì)胞的顏色來選擇轉(zhuǎn)化子
。這是一種具有廣泛應(yīng)用價值的報告基因。另外
，合成的綠色熒光蛋白基因(SGFP-S65T)也已用于報告小麥的基因轉(zhuǎn)化
。
4、外源基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的表達(dá)與表達(dá)分析
廣泛應(yīng)用于在轉(zhuǎn)基因植物中組成型表達(dá)外源基因的啟動子CaMV 35s在谷物類中的作用較弱
。為了增強(qiáng)外源基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的表達(dá)
，人們或利用雙CaMV35s序列，或加入單子葉植物基因的插入子(如玉米Adhl基因的插入子)
，或轉(zhuǎn)而利用單子葉植物基因的啟動子
，如水稻的Actl基因的啟動子和玉米Ubil基因的啟動子。Actl和Ubil啟動子是目前在小麥轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用最普遍的組成型啟動子
。另外
，人工重組的組成型啟動子pEmuGN啟動外源基因在轉(zhuǎn)基因小麥等的表達(dá)強(qiáng)度比CaMV35s高至少10倍。這類重組啟動子在小麥遺傳轉(zhuǎn)化上將大有作為
。
組織和/或器官特異性表達(dá)啟動子的應(yīng)用在小麥轉(zhuǎn)基因上是一個巨大的進(jìn)步
。特別值得一提的是花藥花粉特異性啟動子的利用。De Block等以水稻花藥絨氈層特異性啟動子ca驅(qū)動核糖核酸酶基因Barnse在轉(zhuǎn)基因小麥中表達(dá)
，從而在世界上創(chuàng)造出第一株基因工程雄性不育小麥
。筆者的研究組利用煙草花藥絨氈層特異性啟動子TA29也創(chuàng)造出基因工程雄性不育小麥?div id="jfovm50" class="index-wrap">；蚬こ绦坌圆挥←湹耐晟婆c配套
，將徹底改變目前雜交小麥制種難的狀況。另外
，化學(xué)誘導(dǎo)性啟動子在轉(zhuǎn)基因小麥上也具有巨大的應(yīng)用潛力
。
近年來，對外源基因在轉(zhuǎn)基因小麥上的整合、表達(dá)方式已經(jīng)有一定的研究
，包括分子方面的研究
。一般認(rèn)為，外源基因在轉(zhuǎn)基因小麥上的整合方式與所用的轉(zhuǎn)基因方法有關(guān)
，但無論是用基因槍還是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法
，低拷貝與簡單的整合仍然是占優(yōu)勢的整合方式；導(dǎo)入基因的遺傳在大多數(shù)轉(zhuǎn)基因系法后代中呈孟德爾遺傳
。Bieri等的實驗證明
，與MARs(matrix-associated regions)的目標(biāo)基因(RIP)在轉(zhuǎn)基因小麥的后4代仍然非常穩(wěn)定，但Alvarez等觀察到在T2代有極少數(shù)植株喪失了整合的外源基因
。據(jù)Uze等報道
，外源基因無論以單鏈還是雙鏈，無論是以線形還是以環(huán)形
，都可以整合到小麥的基因組
，但線形基因的轉(zhuǎn)化效率更高。Zupan等觀察到
，農(nóng)桿菌VirE2蛋白能在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中協(xié)調(diào)細(xì)胞核吸取單鏈DNA
。Srivastava等報道了“位點特異性重組” (site-specific recombination)方法，他們利用這一方法成功地將4個4拷貝插入基因位點轉(zhuǎn)化成單拷貝基因
。
此外
，Pederson等還利用熒光原位雜交(FlSH)研究了基因槍法導(dǎo)入的基因在轉(zhuǎn)基因小麥染色體上定位。他們觀察到
，同一品種 (Florida)的不同轉(zhuǎn)基因株系
，外源基因的插入位點不同，例如
，一個株系的插入點在染色體6B
，而另一株系的插入點在染色體2A。這類研究的深入
，將有助于了解插入基因的“位置效應(yīng)”
，從而更好地了解外源基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的表達(dá)及其穩(wěn)定性。
5
、小麥基因轉(zhuǎn)化存在的主要問題
盡管轉(zhuǎn)基因小麥的研究近年來進(jìn)展很快
，但與雙子葉植物相比，甚至與同為谷物類的水稻和玉米相比
，仍然有較大的差距
。最明顯的差距是，轉(zhuǎn)基因雙子葉作物已經(jīng)有幾十個種類的120多個品種已經(jīng)用于生產(chǎn)實踐或已經(jīng)被批準(zhǔn)進(jìn)入大田實驗
，轉(zhuǎn)基因水稻和玉米有若干品種也已經(jīng)用于生產(chǎn)實踐
，而轉(zhuǎn)基因小麥基本還處在建立和優(yōu)化轉(zhuǎn)基因體系階段
。筆者認(rèn)為，造成這種差異的主要原因或在小麥轉(zhuǎn)基因方面存在如下的問題：
第一
，也是最主要的，小麥組織培養(yǎng)技術(shù)問題
。小麥組織培養(yǎng)中植株再生率低和基因型依賴性很強(qiáng)的問題是限制轉(zhuǎn)基因成功及大幅度提高轉(zhuǎn)基因小麥數(shù)量的瓶頸
。植株再生性強(qiáng)的小麥品種，如Bobwhite等
，無論用基因槍法還是農(nóng)桿菌法都己經(jīng)得到轉(zhuǎn)基因植株
，而再生性差的品種則用基因槍也無法得到轉(zhuǎn)基因植株。也正是由于品種的再生問題
，使全世界的轉(zhuǎn)基因小麥都集中在少數(shù)幾個基因型
，而這些基因型又并非生產(chǎn)實踐所需要的或在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用很有限。
第二
，基因轉(zhuǎn)化的受體比較單一
。未成熟胚及其衍生物是小麥轉(zhuǎn)基因的主導(dǎo)受體，而在世界發(fā)展中國家
，有條件周年提供小麥未成熟胚者寥寥無幾
。
第三，過份依獺基因槍法
。目前轉(zhuǎn)基因小麥90%以上是用基因槍法獲得的
，而基因槍法轉(zhuǎn)基因的缺點在雙子葉植物上已經(jīng)表現(xiàn)得很明顯，在此毋須多言
。其實
，這兩個原因在本質(zhì)上是由第一個原因所引起的。另外
，基因槍昂貴的價格也是附帶因素
。
第四，對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物
，特別是轉(zhuǎn)化小麥的機(jī)理缺乏系統(tǒng)而深入的研究
。目前人們已經(jīng)認(rèn)識到，不同種類的農(nóng)桿菌對同一種單子葉植物的侵染能力不同
，甚至同一菌株在不同的培養(yǎng)條件下侵染能力也有明顯差異
。而包括小麥在內(nèi)的一些單子葉植物本身也存在著一些不利于農(nóng)桿菌侵染的因素，如
，細(xì)胞壁的果膠多糖的高度酯化而缺乏農(nóng)桿菌的附著位點;分泌的愈傷誘導(dǎo)物少或缺乏或與雙子葉植物存在明顯的差異
，不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化等。正是由于這些了解
，人們通過選用適宜的農(nóng)桿菌菌株和植物表達(dá)載體
、提高侵染時農(nóng)桿菌的濃度和延長侵染時間
、在共培養(yǎng)時加入vir基因活化劑 (如AS，OH-AS
，雙子葉植物傷流等)以及選用合適的受體基因型
、外植體和培養(yǎng)基等，使農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥有了重大突破
，成功地獲得轉(zhuǎn)基因植株
。
第五，小麥本身為異源6倍體
，基因組較大而復(fù)雜
，導(dǎo)入的外源基因的沉默與修飾更為嚴(yán)重。
第六
，對轉(zhuǎn)基因小麥分子生物學(xué)證據(jù)作用的過分依賴
。這在某中意義上曾扼制了極有優(yōu)勢的花粉管通道法在小麥轉(zhuǎn)基因上的應(yīng)用。
6
、轉(zhuǎn)基因小麥的展望
隨著小麥多種基因轉(zhuǎn)化體系的建立或初步建立
，小麥的轉(zhuǎn)基因研究的進(jìn)展在今后5年將會更快。但這種進(jìn)展將以更高效的植株再生體系的建立和完善為基礎(chǔ)
。以基因槍為主體的轉(zhuǎn)基因研究將轉(zhuǎn)向以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為主體轉(zhuǎn)基因研究
，這一研究將會優(yōu)化或完善農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)基因體系。同時
，基因槍法轉(zhuǎn)化小麥將從研究階段進(jìn)入應(yīng)用階段
，因而將有少量轉(zhuǎn)基因小麥品系或品種進(jìn)入大田試驗或作為品系、品種釋放
?div id="m50uktp" class="box-center"> ；ǚ酃芡ǖ婪ǎ貏e是它與農(nóng)桿菌結(jié)合的方法將被人們普遍接受并廣泛用于小麥轉(zhuǎn)基因的實踐
。各種輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將走向成熟
。抗抗生素基因作為選擇基因?qū)⒒驹谛←溵D(zhuǎn)基因上消失
，代之而來的將是不同的抗除草劑基因
、不同糖類和激素類基因。明顯易見而又對小麥有益的報告基因
，如花色素基因等將會得到較普遍的應(yīng)用
，因而轉(zhuǎn)化子的選擇效率將大為提高。更多的優(yōu)良農(nóng)業(yè)性狀基因?qū)⒈粚?dǎo)入和表達(dá)
，特別是提高面粉
，營養(yǎng)價值、改良面粉加工性狀的品質(zhì)基因
、提高植株抗病性的基因
、提高植株抗旱性的基因和促進(jìn)植株氮的有效利用基因
。更高強(qiáng)度的啟動子和組織、器官特異性啟動子將會被普遍利用
，化學(xué)劑可調(diào)控啟動子也將在部分先進(jìn)的實驗室利用
，象 “位點特異性重組”等單拷貝插入技術(shù)將更加完善并得到應(yīng)用?div id="d48novz" class="flower left">
；蚬こ绦坌圆挥w系將會得到完善
，并初步用于雜交種子的生產(chǎn)?div id="4qifd00" class="flower right">
？钩輨┗蛞矊⒂糜诳刂齐s種的純度。另外
，對外源基因的插入位點和插入方式將有比較清楚的了解
，從而對外源基因的表達(dá)與沉默將有更清楚的了解。同時
，反義基因技術(shù)將初步用于對小麥功能基因的研究
。
或
一、植物的遺傳轉(zhuǎn)化
20世紀(jì)70年代末80年代初
，人們用野生型Ri和Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草和馬鈴薯細(xì)胞獲得再生植株后
，以Ti質(zhì)粒為載體的植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)隨之被建立。近年來植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到了迅速發(fā)展
，建立了多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)
。按照基因引入受體植物細(xì)胞的方法，植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)大體可分為兩類：以載體為媒介的基因轉(zhuǎn)移和基因或DNA的直接轉(zhuǎn)移
。所謂以載體為媒介的基因轉(zhuǎn)移就是將目的基因連于某一載體DNA上
，然后通過寄主感染受體植物等途徑將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的技術(shù)。DNA的直接轉(zhuǎn)移是指利用植物細(xì)胞生物學(xué)特性
，通過物理
、化學(xué)和生物學(xué)方法將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的技術(shù)。
（一）載體法轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是最主要的一種載體轉(zhuǎn)化方法
。利用經(jīng)過改造的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒為載體可以高效地轉(zhuǎn)移外源基因
。所獲得的轉(zhuǎn)化植物有兩種基本方法：一種是1979年Marton等以植物原生質(zhì)為受體的共培養(yǎng)法（ocultivation）；一種是1985年Horsch等人建立的葉盤法（leaf disc cocultivation）
。
共培養(yǎng)法是把農(nóng)桿菌與植物原生質(zhì)體共同培養(yǎng)以實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的方法
。其程序包括農(nóng)桿菌對初生細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化并再生植株
。
葉盤法實際上是對共培養(yǎng)法加以改進(jìn)后而創(chuàng)立的一種轉(zhuǎn)化方法
。用農(nóng)桿菌感染葉片外植體并短期共培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中
，農(nóng)桿菌的vir基因被誘導(dǎo)
，它的活化可以啟動T-DNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移
。共培養(yǎng)后，也要進(jìn)行轉(zhuǎn)化的外植體的篩選
、愈傷組織的培養(yǎng)
、誘導(dǎo)分化等步驟，以得到再生植株
。葉盤法由于不需進(jìn)行原生質(zhì)體操作等
，方法簡單，獲得轉(zhuǎn)化植株也更快
，是用植物外植體為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的一個良好途徑
。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是大多數(shù)雙子葉植物轉(zhuǎn)化中常采用的方法，但由于農(nóng)桿菌具有宿主局限性
，極少能感染單子葉植物
，特別是一些重要的農(nóng)作物如水稻、小麥
、玉米等對農(nóng)桿菌不敏感
，難于應(yīng)用此法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
除上述以Ti質(zhì)粒為載體的基因轉(zhuǎn)化外
，還可以用脂質(zhì)體（liposome）為載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化
。脂質(zhì)體是由磷脂組成的膜狀結(jié)構(gòu)，因此可將DNA分子包裝在脂質(zhì)體內(nèi)以避免受體細(xì)胞DNase的降解
，把DNA分子導(dǎo)入到植物的原生質(zhì)體中去
。
（二）基因直接轉(zhuǎn)移的方法 這是指既不依賴于農(nóng)桿菌，也不依賴其他載體或媒介的一些基因轉(zhuǎn)移方法
。
1．電激和電注射法 電脈沖能改變細(xì)胞膜的透性
。通過高壓電脈沖的電激穿孔作用把外源DNA引入植物原生質(zhì)體的方法就稱為電激法（electroporation）。這種方法現(xiàn)已較廣泛地應(yīng)用于單子葉和雙子葉植物以及動物的基因轉(zhuǎn)移
，如20世紀(jì)80年代末用此法將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPT Ⅱ）基因轉(zhuǎn)入玉米自交系的原生質(zhì)體
，已再生成植株。
通過電激技術(shù)把基因直接引入完整的植物細(xì)胞或組織的方法
，稱作電注射（electroinjection）
。這種方法可避免原生質(zhì)體培養(yǎng)和再生成植株的繁雜操作與困難，因而具有巨大的應(yīng)用潛力
。
2．基因槍法 基因槍法又稱粒子轟擊技術(shù)（particle bombardment）
。這一方法是用粒子槍把表面吸附有外源DNA的金屬微粒高速地射進(jìn)植物細(xì)胞或組織。由于此法快速簡便
，不受宿主范圍限制
，而受體植物細(xì)胞不需去除細(xì)胞壁，轉(zhuǎn)化率又高
，被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織容易再生成植株
，因而頗受關(guān)注
。
3．微注射法 微注射法（microinjection）是利用顯微注射儀等，通過機(jī)械的方法將外源基因或DNA直接注入細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)
。與其他方法相比
，這個方法對外源遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入更為直接和有效。
微注射法除用于植物細(xì)胞外
，近些年還發(fā)展到用于直接注射植物子房
，這樣更有利于外源遺傳物質(zhì)對幼胚的轉(zhuǎn)化。這方面的工作我國于20世紀(jì)70年代即已進(jìn)行了理論與實踐的探索
，并已獲得抗枯萎病的棉花轉(zhuǎn)化植株抗蟲棉等
。
二、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)及其應(yīng)用
（一）轉(zhuǎn)基因動物的概念 借助基因工程技術(shù)把外源目的基因?qū)肷臣?xì)胞
、胚胎干細(xì)胞和早期胚胎
，并在受體染色體上穩(wěn)定整合，使之經(jīng)過各種發(fā)育途徑得到能把外源目的基因傳給子代的個體
，即轉(zhuǎn)基因動物（transgenic animal）
。轉(zhuǎn)入的目的基因稱為轉(zhuǎn)基因（transgene）
，這種轉(zhuǎn)移目的基因的過程稱為轉(zhuǎn)基因作用（transgenesis）
。關(guān)于“轉(zhuǎn)基因”的概念，通常只限于動
、植物中經(jīng)基因工程技術(shù)進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移
，因此品種間不論有性或無性雜交獲得新基因的途徑都不屬此范疇。
（二）轉(zhuǎn)基因動物技術(shù) 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的一項生物技術(shù)
，它克服了物種之間的生殖隔離
，實現(xiàn)了動物物種之間遺傳物質(zhì)的交換和重組。根據(jù)外源基因?qū)氲姆椒ê蛯ο蟮牟煌?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">，至今主要?種途徑可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物
，即顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒法和胚胎干細(xì)胞法
。反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移基因的基本方法在前面已有簡介
，這里只介紹顯微注射法和胚胎干細(xì)胞法兩種。
1．受精卵原核顯微注射法 顯微注射技術(shù)是從動物胚胎學(xué)研究移核實驗的基礎(chǔ)上發(fā)展而來
。20世紀(jì)80年代初期人們利用這一方法向動物生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移外源基因
，成功地建立了轉(zhuǎn)基因小鼠。1985年轉(zhuǎn)基因綿羊和轉(zhuǎn)基因豬問世
，以后轉(zhuǎn)基因大鼠
、兔、雞
、牛
、魚等都已陸續(xù)取得成功
，可見顯微注射法是迄今應(yīng)用得較為普遍而又最有成效的一種獲得轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)。
本方法是在顯微鏡下
，用直徑約為1μm的玻璃管直接插入受精卵的雄原核內(nèi)
，將毛細(xì)管內(nèi)所帶有的外源基因的DNA注入原核，然后將其移植到假孕母體輸卵管或子宮內(nèi)并發(fā)育成子代個體
。為了解轉(zhuǎn)基因的整合情況
，可酌情應(yīng)用斑點雜交、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或Southern印跡雜交等方法對子代個體DNA進(jìn)行檢測
。
顯微注射法的優(yōu)點是導(dǎo)入的外源基因片段可長達(dá)50 kb
，且無需載體，外源基因在宿主染色體上的整合率相對較高
。其不足之處是外源基因的整合是隨機(jī)的
，因而難以控制其整合率；再者
，對外源基因能否穩(wěn)定整合于受體基因組的檢測
，必須等到子一代個體出生后經(jīng)過選擇才能確定，不利于在生育期長
、產(chǎn)仔少的大家畜中應(yīng)用
。
2．胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法 胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES）是指從哺乳動物胚胎囊胚期內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)中分離出來的尚未分化的胚胎細(xì)胞
，這種細(xì)胞具有發(fā)育的多能性
，能夠分化出各種組織。20世紀(jì)80年代中期人們開始研究利用ES細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因動物的方法
。這個途徑是將外源基因直接導(dǎo)入ES細(xì)胞
，經(jīng)體外培養(yǎng)篩選后再注入到受體囊胚腔中，與其中的囊胚細(xì)胞聚集在一起
，成為受體胚胎的一部分
，參與其分化。由這種胚胎發(fā)育而成嵌合體的轉(zhuǎn)基因動物
，即其中有一部分組織來源于整合有外源基因的供體ES細(xì)胞
。在嵌合過程中，被轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞分化而成的生殖細(xì)胞可通過雜交將引入的外源基因傳遞下去
。
在以胚胎干細(xì)胞為媒介獲得轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)中
，既可以用多種方法將外源基因?qū)隕S細(xì)胞，且細(xì)胞的鑒定
、篩選比較方便
，又可預(yù)先在細(xì)胞水平上測定外源基因的拷貝數(shù)、定位和表達(dá)的水平以及插入的穩(wěn)定性等，而且將ES細(xì)胞注入囊胚的操作較易進(jìn)行
，整合率相對較高
。只是建立ES細(xì)胞系本身就是一項難度極高的工作，目前小鼠ES細(xì)胞系雖已建立
，但在豬
、羊中還未能得到真正穩(wěn)定的ES細(xì)胞株。
（三）轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用 轉(zhuǎn)基因動物的研究內(nèi)容非常廣泛
，20世紀(jì)80～90年代以來從基礎(chǔ)理論到應(yīng)用技術(shù)在深度和廣度上都有了很大發(fā)展
，并已日漸由實驗室走向生產(chǎn)實踐。
1．在基因表達(dá)調(diào)控研究方面的應(yīng)用 利用轉(zhuǎn)基因動物可作為在體內(nèi)研究外源基因表達(dá)調(diào)控的“反應(yīng)器”
，下面僅就DNA順式調(diào)控元件和基因在發(fā)育中的時空調(diào)節(jié)為例予以介紹
。
（1）順式調(diào)控元件的研究 異常的脂蛋白水平與動脈粥樣硬化等疾病有關(guān)。人類有5種脂蛋白
，各自含有不同的載脂蛋白?div id="4qifd00" class="flower right">
，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約有17種載脂蛋白，它們的編碼基因已測序
，是用于研究心血管疾病的候選基因
。把載脂蛋白基因轉(zhuǎn)入小鼠，可用來研究人脂蛋白代謝
、調(diào)控以及動脈粥樣硬化
。在研究載脂蛋白基因組織特異性表達(dá)的順式調(diào)控元件時，發(fā)現(xiàn)有兩簇載脂蛋白基因凋節(jié)的組織特異性表達(dá)（圖19-15）
。一簇包括A－Ⅰ
、C-Ⅲ和 A-Ⅳ基因
，定位于人11號染色體長臂2區(qū)3帶（11q23）
，是按A－Ⅰ、C－Ⅲ
、A－Ⅳ的順序組成
。C－Ⅲ的轉(zhuǎn)錄方向與其他兩個基因相反。 A-Ⅰ和C-Ⅲ主要在肝和小腸中表達(dá)
，A-Ⅳ主要在小腸表達(dá)
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