研究發(fā)現(xiàn)lin28a型蛋白質(zhì)有自愈力,或可治療癌癥

最近，《細(xì)胞》雜志發(fā)表文章，稱研究發(fā)現(xiàn)一種名叫l(wèi)in28a的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)能夠有助于組織的修復(fù)，這將對治療癌癥有積極作用。

研究表明，那些會產(chǎn)生lin28a型蛋白質(zhì)的老鼠，其毛發(fā)會比普通的老鼠長得更快，如果這種老鼠的耳朵被刺傷，則幾乎能夠完全愈合。而攜帶這種蛋白質(zhì)的老鼠在幼年時被剪掉腳趾，則會完全長出新的來。

然而，研究人員發(fā)現(xiàn)，并不是帶有l(wèi)in28a蛋白質(zhì)就一定具備特別的愈合能力。比如，心臟再生就沒有表現(xiàn)出任何改進。如果老鼠已經(jīng)進入青年期，那么其被剪掉的腳趾就沒法再長回來了，然而其毛發(fā)仍會迅速生長，耳朵的軟骨和結(jié)締組織還會繼續(xù)生長。

密歇根大學(xué)的daniel goldman一直研究lin28a在斑馬魚視網(wǎng)膜再生過程中的作用，他認(rèn)為，類似于心臟的組織具有某種抗拒重置的機制。

波士頓兒童醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)家吳軾昌也是該項研究的作者之一，他說，事實上，代謝機制在組織愈合中的作用是最令人驚訝的，大多數(shù)生物學(xué)家都認(rèn)為只有特定要素才能夠產(chǎn)生愈合效用，而這一最新的研究結(jié)果則表明，每一個細(xì)胞都可以做到這一點。這一最新的研究成果要實現(xiàn)臨床醫(yī)療應(yīng)用還有很長的道路要走。

什么是蛋白質(zhì)組學(xué)？

這個概念最早是在1995年提出的，它在本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識。

目前，在蛋白質(zhì)功能方面的研究是極其缺乏的。大部分通過基因組測序而新發(fā)現(xiàn)的基因編碼的蛋白質(zhì)的功能都是未知的，而對那些已知功能的蛋白而言，它們的功能也大多是通過同源基因功能類推等方法推測出來的。有人預(yù)測，人類基因組編碼的蛋白至少有一半是功能未知的。因此，在未來的幾年內(nèi)，隨著至少30種生物的基因組測序工作的完成，人們研究的重點必將轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)功能方面，而蛋白質(zhì)組的研究正可以完成這樣的目標(biāo)。在蛋白質(zhì)組的具體應(yīng)用方面，蛋白質(zhì)在疾病中的重要作用使得蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病的研究中有著極為重要的價值。

疾病的產(chǎn)生可能僅僅是因為基因組中一個堿基對的變化，如β-血紅蛋白第六位上的Glu變?yōu)閂al就導(dǎo)致了鐮刀型細(xì)胞貧血癥的發(fā)生。然而，對于大多數(shù)疾病來說，其疾病發(fā)生機制要復(fù)雜的多。因此，對于疾病發(fā)生的分子機制的認(rèn)識就需要一些能夠解決這些復(fù)雜性的方法來完成。而作為細(xì)胞中的活性大分子，蛋白質(zhì)無疑是與疾病相關(guān)的主要分子，蛋白表達水平的改變是與疾病，藥物作用或毒素作用直接相關(guān)的。因此，基于蛋白質(zhì)整體水平的蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病研究中無疑將發(fā)揮重要作用。

現(xiàn)在，蛋白質(zhì)組學(xué)在人類疾病中的應(yīng)用已經(jīng)在一些疾病如皮膚病，癌癥，心臟病中廣泛開展了，而這些研究則主要集中在這樣幾個方面：尋找和疾病相關(guān)的單個蛋白，整體研究某種疾病引起的蛋白表達或修飾的變化，利用蛋白質(zhì)組尋找一些致病微生物引起的疾病的診斷標(biāo)記和疫苗等。下面，我們就將就蛋白質(zhì)組學(xué)的基本技術(shù)和這些領(lǐng)域的應(yīng)用作一些介紹。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)
對于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究來說，它的最基本的實驗手段就是利用雙向凝膠電泳(two-dimensional protein electrophoresis, 2DE)，在整個 基因組水平上檢測蛋白質(zhì)表達的情況。雙向凝膠電泳首先利用等電點聚焦來分離不同等電點的蛋白，再利用SDS－PAGE來分離不同分子量的蛋白，其分辨率是非常高的。微克級的蛋白質(zhì)就可以被很好的分辨開了，如在微克級水平上，有人從一個蛋白混合物中最多分開了11200種蛋白質(zhì)，數(shù)量是非?？捎^的。因而，微克級的蛋白的雙向凝膠電泳常被用來初步檢測表達或修飾有變化的蛋白。然后，同樣的蛋白混合物樣品可用于毫克級的2DE，這樣，電泳圖譜上的每一個多肽就可被純化并進行下一步的分析，如質(zhì)譜，末端或中間的氨基酸序列分析等。

僅僅進行雙向凝膠電泳顯然是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因為由雙向電泳得到的蛋白質(zhì)表達情況的變化并不能和具體的何種蛋白表達出了變化聯(lián)系起來。而一些如蛋白質(zhì)印跡或凝集素親和印跡等傳統(tǒng)技術(shù)對于這方面的信息也幫助不大。為了鑒定這些由電泳得來的蛋白，質(zhì)譜(MS，mass spectrometry)被廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)中。對于蛋白質(zhì)的鑒定，有兩種方法用的最為廣泛，即MALDI－MS ( matrix-assisted laser desorption ionization)和ESI－MS (electrospray ionization)。這兩種方法各有自己的 適用范圍，通常前者對于分析高分子量的蛋白更有效，而后者對于蛋 白的檢測靈敏度更高，?？蛇_到飛克級水平以下。質(zhì)譜可以用于蛋白質(zhì)分析主要是因為它可以提供特定蛋白的不同方面的結(jié)構(gòu)信息，如它可直接測定蛋白或多肽的分子量信息，也可用來獲得一些蛋白質(zhì)序列信息等。同時，質(zhì)譜也可通過多肽片段分子量的改變來得到一些關(guān)于糖型，磷酸化和其它翻譯后修飾的數(shù)據(jù)。因此，質(zhì)譜對于蛋白質(zhì)的鑒定是非常重要的，而它的進展也無疑會大大促進蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進展。

單個的疾病相關(guān)蛋白的尋找
在疾病發(fā)生過程中，由于和疾病相關(guān)的遺傳信息的變化常常會導(dǎo)致蛋白的種類和數(shù)量發(fā)生變化，而這些變化是可以被可以被高解析度的雙向凝膠電泳所檢測到的，這就是利用蛋白質(zhì)組學(xué)尋找和鑒定疾病相關(guān)蛋白的依據(jù)。

結(jié)腸癌的產(chǎn)生是一個包含了多個基因突變的多步過程，這其中包括抑癌基因的功能喪失，癌基因的活化等。然而，腫瘤發(fā)生的具體機制仍不清楚。對于這樣一種涉及多種蛋白的疾病，人們已經(jīng)開始利用蛋白質(zhì)組學(xué)來分析結(jié)腸粘膜發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的多肽的變化了。對照15例結(jié)腸癌病人和13例正常人的結(jié)腸表皮的雙向凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者分別含有882個和861個點，而這些點中，有一個蛋白，其分子量為 13kDa，等電點為5.6，它只在腫瘤組織中專一性的表達。在15個癌癥樣品中，有13例的此蛋白表達上調(diào)，占到了87%。進一步的研究也證實了這個蛋白在不同程度的癌癥引起的發(fā)育異常中也有明顯的表達水平上的差異。由雙向電泳發(fā)現(xiàn)的這個可能與癌癥相關(guān)的蛋白到底是什么蛋白呢？從電泳的凝膠上得到的這個點經(jīng)胰蛋白酶水解后，得到的肽段由μ－HPLC分離后測序。測序的結(jié)果拿到兩個序列，LGHPDTLNQ和VIEHMEDLDTNADK，這與鈣粒蛋白B的情況完全吻合。進一步的用MALDI－MS分析的結(jié)果也證實了這個蛋白就是鈣粒蛋白B。同時，結(jié)合以前的發(fā)現(xiàn)，即由鈣粒蛋白B和A組成的異源二聚體蛋白鈣防衛(wèi)蛋白在胃腸腫瘤病人的糞便樣品中含量有很大提高，鈣粒蛋白B在腫瘤性轉(zhuǎn)化的組織中的高專一性存在顯示出它在結(jié)腸癌的產(chǎn)生中具有重要的作用。盡管蛋白的具體功能還需要進一步的闡明，但這個例子已經(jīng)可以證明，由蛋白質(zhì)組學(xué)方法尋找疾病相關(guān)蛋白肯定是可行的。

這方面的另一個例子是關(guān)于肝細(xì)胞癌的研究。雙向凝膠電泳已經(jīng)被成功的用于發(fā)現(xiàn)化學(xué)誘導(dǎo)的鼠的肝癌相關(guān)蛋白中。而雙向電泳和蛋白質(zhì)化學(xué)方法的聯(lián)合應(yīng)用也更深化了對這些癌癥相關(guān)蛋白的具體特征的認(rèn)識。在用N－甲基－N－亞硝基脲誘導(dǎo)了鼠的肝癌后，利用雙向電泳發(fā)現(xiàn)了一些表達有變化的蛋白，經(jīng)氨基酸序列分析后，分析其中一個蛋白是來源于肝癌的醛糖還原酶樣蛋白( hepatoma-derived aldose reductase-like protein)。這個蛋白分子量為35KDa，等電點為7.4，它是 一種在肝癌和胚胎的肝中特異性表達的蛋白。利用雙向電泳得到了這樣一種可能和癌癥相關(guān)的蛋白后，一些蛋白質(zhì)化學(xué)的方法可用來對這種蛋白和疾病的相關(guān)性作進一步的研究。有人利用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，直接針對來源于肝癌的醛糖還原酶樣蛋白的抗體FR－1表明，這個蛋白在化學(xué)誘導(dǎo)的肝癌小鼠的發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化的前期和轉(zhuǎn)化的早期就已經(jīng)有很強的表達了，而正常肝組織中并無表達。這都是該蛋白涉及肝癌發(fā)生過程的有力證據(jù)。

已有的一些關(guān)于此蛋白的研究表明，醛糖還原酶是還原酶超家族的成員，在山梨糖醇途徑中它可以催化葡萄糖向山梨糖醇的轉(zhuǎn)化，而且在一些糖尿病的并發(fā)癥的發(fā)生中它也有作用。作為一種酶，它可以水解一些生物異源物質(zhì)等，因此它也參與了一些解毒過程。而在肝癌發(fā)生過程中，一些解毒酶的表達水平或活力增高已是公認(rèn)的事實了。對于醛糖還原酶這一類有解毒功能的蛋白來說，只有由雙向電泳發(fā)現(xiàn)的肝癌來源的醛糖還原酶樣蛋白是與肝癌相關(guān)的。它首先在胚胎肝中表達，但在成年的肝中就不表達了。肝癌發(fā)生時，它又重新表達了。因此，目前可以初步推斷，醛糖還原酶樣蛋白在肝癌發(fā)生過程中是與肝的解毒過程相關(guān)的?，F(xiàn)在，在人的肝癌中，也找到了鼠的醛糖還原酶樣蛋白的同源蛋白，它同樣是在人的不同組織中選擇性表達的。

疾病相關(guān)蛋白的整體研究
對于大多數(shù)疾病來說，疾病造成的往往不只一個或幾個蛋白的變化，參與疾病過程的蛋白的數(shù)目也是很大的，因此除了通過雙向凝膠電泳來尋找與疾病相關(guān)的單個蛋白外，通過蛋白質(zhì)組對表達情況有變化的蛋白在整體水平上的研究同樣是非常重要的。目前，在利用雙向凝膠電泳進行的蛋白整體水平的研究方面，擴張性的心肌病(Dilated cardiomyopathy, DCM)是一個較好的例子。

擴張性的心肌病是一種嚴(yán)重的心臟疾病，對于這種疾病的致病機理和涉及的分子都還不清楚，而且，對于這樣一種復(fù)雜的疾病來說，也不可能僅由一種致病機理造成。因此，對于這樣的疾病，從整體的蛋白質(zhì)組水平來研究是極為必要的。另外，相對其它組織而言，主要由心肌細(xì)胞組成的心臟是一種相對均一的組織，這也為用雙向凝膠電泳進行蛋白質(zhì)組的研究提供了良好的基礎(chǔ)。對DCM的蛋白質(zhì)組的研究在九十年代初就已經(jīng)開始了，目前，心肌的雙向凝膠電泳的數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立。盡管國際上各實驗室之間的數(shù)據(jù)之間有著如不同的樣品制備，不同的等電聚焦條件，不同的凝膠大小等差異，但這些數(shù)據(jù)的比較證明，在大多數(shù)情況下，不同蛋白的點的位置還是相對穩(wěn)定的，可以進行大規(guī)模的比較研究。

在Knecht等人的研究中，得到了一個高解析度的具有大約3300個心肌蛋白點的雙向電泳結(jié)果，并對其中的150個蛋白進行了氨基酸分析，N端和中間的Edman降解以及MALDI－MS等一系列鑒定。而對幾百個正常和擴張性心肌病的病人的2－DE結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，兩者的蛋白條帶具有可比性。除去一些可能由不同的疾病有關(guān)參數(shù)如患病程度，用藥情況，病人年紀(jì)等因素造成的無重復(fù)性的點的多少和強度的變化外，患病者和正常人有25種蛋白在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異。這些即是DCM相關(guān)蛋白。而這個結(jié)果是在對幾百個樣品的大規(guī)模研究的基礎(chǔ)上得來的，而也只有大規(guī)模的研究，才能體現(xiàn)出這個結(jié)果在實際應(yīng)用前景上的價值。對于這幾十種疾病相關(guān)蛋白，我們可以用一些其它方法，如免疫組化，酶活測定等，來作進一步的鑒定，確認(rèn)它們與疾病的相關(guān)性以及它們在疾病中的作用等。這些工作都是在基于蛋白質(zhì)組的研究基礎(chǔ)上進一步的深入而進行的，顯然，在幾百個DCM患者和正常對照的樣品的大規(guī)模水平上對疾病相關(guān)蛋白的整體研究無疑是最為基礎(chǔ)和有效的。

病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
近幾年來，關(guān)于傳染病的研究變得比原來更為重要。一些新的傳染原，如Borrelia burgdorferi，HIV，Ebola病毒等的出現(xiàn)，使得一些原來認(rèn)為已被控制的疾病如結(jié)核，多抗藥性的鏈球菌屬感染等又有所增 加。因此，對于有毒力的微生物和病毒進行蛋白質(zhì)組學(xué)的分析就顯得非常必要，它可以用來尋找和研究毒力因子，抗原，疫苗等，而這些對于疾病的診斷，治療和防治是極為重要的。目前，已經(jīng)有18種微生物的基因組測序已經(jīng)完成，而另有60多種的微生物的基因組測序正在進行當(dāng)中，這些基因序列的信息和相對真核組織來說少得多的基因數(shù)量都為蛋白質(zhì)組的研究提供了良好的基礎(chǔ)。

疏螺旋體屬的Borrelia burgdoferi是引起多系統(tǒng)疾病人類Lyme氏疏 螺旋體病的主要致病因子。這種疾病的癥狀開始時常表現(xiàn)為一些環(huán)狀紅斑樣皮疹以及流感樣癥狀，發(fā)展下去也會造成一些神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥和關(guān)節(jié)炎等。目前，對這種疾病的診斷主要是通過臨床癥狀的判斷并輔以血清學(xué)實驗如ELISA，免疫印跡等來證實。由于這些實驗具有不同程度的敏感性和特異性，診斷并不是標(biāo)準(zhǔn)化的。利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供一些新的較為標(biāo)準(zhǔn)的診斷標(biāo)記就顯得尤為必要了。

Borrelia burgdoferi的染色體上有853個基因，它的11個質(zhì)粒上有額 外的430個基因。它的雙向凝膠電泳圖譜大約有300個點，由這些蛋白點就可以尋找免疫相關(guān)抗體等蛋白了。將銀染的 Borrelia burgdoferi的 2DE凝膠上的其中217個點編號后，用來源于兔子的多克隆抗體采用免 疫雜交的方法鑒定了一些抗原在膠上的位置，如外表面蛋白A(OspA)，OspB，OspC，p83/100，p39，flagellin p41等。除了p83/100外，所有 抗原在2DE圖上都存在于不只一個點上。利用不同表現(xiàn)癥狀的Lyme氏 疏螺旋體病病人的血清與疏螺旋體的2DE圖進行印跡分析發(fā)現(xiàn)，具有 紅斑遷移癥狀的十個病人的血清中分別含有60種和88種抗原的IgM型和IgG型抗體，而關(guān)節(jié)炎病人的血清中含有15種抗原的IgM抗體和76種不同抗原的IgG抗體，晚期神經(jīng)疏螺旋體病人的血清中則含有33種抗原的IgM抗體和76種抗原的IgG抗體，但在這三種不同疾病時期的病人血清中都含有這樣幾種抗原的抗體,OspA，OspB，OspC，flagellin，p83/100，p39等，這幾個抗原同時也是原來血清學(xué)實驗中用來診斷的標(biāo)記，蛋白質(zhì)組的結(jié)果驗證了原來診斷的合理性，同時，2DE的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了一些原來并沒有發(fā)現(xiàn)的抗原，這些正是一些新的潛在的診斷標(biāo)記。更多診斷標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)對于診斷的標(biāo)準(zhǔn)化和準(zhǔn)確性的提高大有幫助。

弓形蟲病是由原生動物Toxoplasma gondil寄生感染引起的，全世 界約有30%的人攜帶此種寄生蟲，而在歐洲，弓形蟲病是發(fā)生頻率最 高的傳染病之一，因此，這種疾病的危害是相當(dāng)高的。在健康人群中，寄生蟲的感染通常是無癥狀的或癥狀極其輕微的，但如果是懷孕期間感染，寄生蟲就會通過胎盤，并造成胎兒的死亡。隨著懷孕時間的增加，寄生蟲穿透的可能性也會增加。因此，確定感染的時間就顯得非常重要了。另一方面，懷孕不同時期的感染后果也是不同的，在懷孕早期，器官形成過程時的感染危害可能是致死的，而懷孕的后期，胎兒的感染經(jīng)常會導(dǎo)致一些并發(fā)癥的出現(xiàn)如視網(wǎng)膜色素異常等。如果在懷孕期間感染的婦女得到了充分的治療，胎兒感染的可能和后果的嚴(yán)重性都會大大降低。因此，及時的診斷和準(zhǔn)確判斷感染時間對于弓形蟲病的治療是非常重要的。

但實際上，90%以上的懷孕婦女的初期感染都不能被及時發(fā)現(xiàn)。目前的診斷主要是依靠血清學(xué)手段和PCR方法，而用血清學(xué)的方法來檢測抗體對于一些無免疫應(yīng)答的和懷孕的病人顯然是不夠的，而潛伏性感染致病恰恰是經(jīng)常發(fā)生在無免疫應(yīng)答的人中。如在艾滋病患者中， T.gondil就是導(dǎo)致腦內(nèi)病變并致死的主要原因。由這些都可看出，疾病的有效的診斷對于有效的治療是非常關(guān)鍵的。同樣，蛋白質(zhì)組水平上的研究為這方面的進展提供了非常有力的方法。我們可以用不同感染情況的病人的血清和T.gondil的2DE圖進行免疫印跡來尋找和感染相關(guān)的抗 原來作為診斷標(biāo)記。這些不同的血清包括：急性感染弓形蟲病的 懷孕婦女的血清，急性弓形蟲病的非懷孕病人的血清，潛伏性感染弓形蟲的尚未發(fā)病者的血清。結(jié)果顯示，2DE圖上的9個點可以和感染者血清中的任一類型的免疫球蛋白反應(yīng)，且這種反應(yīng)和感染的狀態(tài)和發(fā)病與否無關(guān)，這9個點就可用來作為T.gondil 感染的標(biāo)記。另外有7個點 和抗體的反 應(yīng)則與抗體類型或發(fā)病情況有關(guān)，可用來區(qū)分不同疾病狀 況如潛伏期和急性期等，它們同樣可作為進一步判斷感染狀態(tài)的診斷標(biāo)記使用。

小結(jié)
雙向凝膠電泳就象一個分子顯微鏡，將復(fù)雜的蛋白混合物分離開來，而進一步的由疾病和對照的比較可以找到一些疾病相關(guān)蛋白。目前，蛋白質(zhì)組的應(yīng)用最多的領(lǐng)域就是通過疾病和對照的2DE條帶的比較尋找單個的疾病相關(guān)蛋白，鈣粒蛋白B在結(jié)腸癌中的表達上調(diào)和肝癌來源的醛糖還原酶樣蛋白在鼠的肝癌發(fā)生過程中的重新表達就是兩個典型的例子。這些蛋白和疾病的相互關(guān)系還可以通過免疫組化等方法進一步的鑒定。而另一方面，利用蛋白質(zhì)組來進行整體水平上的研究也是不可缺少的。如對擴張性心肌病的研究就顯示出了患病者和對照的 25種蛋白的顯著差異，人的心肌的包括了3300個蛋白的雙向凝膠電泳數(shù)據(jù)庫也已經(jīng)建立了。對于整體水平上的研究而言，規(guī)模越大，使用樣品數(shù)目越多，對分子機制的研究可能就越深入，因而國際間的協(xié)作是非常重要的。蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用的另一領(lǐng)域是在致病微生物的診斷用蛋白的尋找方面，如在上面所提到的Borrelia burgdoferi引起的Lyme氏 疏螺旋體病和Toxoplasma gondil引起的弓形蟲病等，由蛋白質(zhì)組學(xué)得 來的診斷標(biāo)記甚至還可用來區(qū)分不同的疾病時期，這些都為有效的 診斷檢測的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在蛋白質(zhì)功能和人類疾病研究方面為我們開辟了一個新的領(lǐng)域，盡管它還處于剛剛起步的不成熟期，很多技術(shù)還有待完善和發(fā)展，但它的潛力是不可低估的，在將來，蛋白質(zhì)組在人類疾病中的應(yīng)用也必然會更加廣泛和深入。

ras基因及信號通路

ras基因首先在Harvery鼠肉瘤病毒（Ha-MSV）和Kirsten鼠肉瘤病毒（Ki-MSV）的子代基因中被發(fā)現(xiàn)，在這種子代病毒中發(fā)現(xiàn)含有來源于 宿主細(xì)胞 的基因組的新基因序列，此后人們將這種宿主細(xì)胞基因稱為ras基因。

KRAS基因突變與肺癌、胰臟癌和大腸癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系，52﹪的肺腺癌病人有KRAS基因的突變。臺灣地區(qū)胰臟癌的病人的研究結(jié)果顯示，有高達90﹪突變率。

1982年Weinberg和Barbacid首先從人膀胱癌細(xì)胞系中分離出一種轉(zhuǎn)化基因，可使 NIH 3T3 細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，而從正常人組織中提取的DNA則無此種作用。隨后，Santos與Parada發(fā)現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化基因并非新型基因，而是Harvery鼠肉瘤病毒ras基因的人類同源基因，命名為H2ras。同年，Krontiris在人肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Kirsten鼠肉瘤病毒基因的同系物，稱為K-ras.另一種相似的基因是在人 神經(jīng)母細(xì)胞瘤 DNA感染NIH3T3細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)的與ras類似的基因，稱為N2ras，此種基因和病毒無關(guān).

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ras基因 在進化中相當(dāng)保守，廣泛存在于各種 真核生物 如哺乳類，果蠅，真菌，線蟲及酵母中，提示它有重要的生理功能.哺乳動物的ras基因家族有三個成員，分別是H-ras,K-ras,N-ras，其中K-ras的第四個外顯子有A,B兩種變異體.各種ras基因具有相似的結(jié)構(gòu)，均由四個外顯子組成，分布于全長約30kb的DNA上.它們的編碼產(chǎn)物為 相對分子質(zhì)量 2.1萬的蛋白質(zhì)，故稱為P21蛋白.已證明，H-ras位于人類11號染色體短臂上（11p15.1～p15.3),K-ras位于12號染色體短臂上（12p1.1～pter),N-ras位于1號染色體短臂上（1p22-p32），除了K-ras第四個外顯子有變異外，每個ras基因編碼P21的序列都平均分配在四個外顯子上，而內(nèi)含子的序列及大小相差很大，因而整個基因也相差很大，如人K-ras有35kb長，而N-ras長為3kb.由于有兩個第四號外顯子，K-ras可以兩種方式剪接，但編碼K-ras-B的mRNA含量高.除K-ras-B含有188個氨基酸外，其他兩種 Ras蛋白 均含有189個氨基酸.

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3.1 Ras蛋白的結(jié)構(gòu)

Ras蛋白為膜結(jié)合型的GTP/GDP 結(jié)合蛋白 ， 相對分子質(zhì)量 為2.1萬，定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè).它由188或189個氨基酸組成，它的第一個結(jié)構(gòu)域為含有85個 氨基酸殘基 的 高度保守序列 ，接下來含有80個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域中，Ras蛋白結(jié)構(gòu)輕微不同，除了K2Ras末端25個氨基酸由于不同的外顯子而分為A型和B型外，其余Ras家族成員最后四個氨基酸均為Cys1862A2A2X2COOH序列.Ras蛋白存在4種異構(gòu)型：H2Ras,N2Ras,K2Ras4A和K2Ras4B，它們是3種基因的產(chǎn)物，其中K2Ras4A和K2Ras4B是同一基因不同剪接的結(jié)果.

3.2 Ras蛋白的功能

Ras(P21）蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，它在 傳遞細(xì)胞 生長分化信號方面起重要作用.它屬于 三磷酸鳥苷 （GTP）結(jié)合蛋白（一種細(xì)胞信息傳遞的耦聯(lián)因子），通過GTP與 二磷酸鳥苷 （GDP）的相互轉(zhuǎn)化來調(diào)節(jié)信息的傳遞.P21與GTP和GDP有很強的親和性，而且有較弱的GTP酶活性.正常情況下P21和GDP結(jié)合處于失活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞外的生長分化因子把信號傳導(dǎo)到胞膜內(nèi)側(cè)的P21時，可增強P21與GTP結(jié)合活性，使P21和GTP結(jié)合成為激活狀態(tài)，信號系統(tǒng)開放.因為P21有GTP酶活性，可使GTP水解成GDP,P21和GDP結(jié)合后P21失活，信號系統(tǒng)關(guān)閉.正常情況下P21的GTP酶活性很弱，當(dāng)和 GTP酶激活蛋白 (GAP）結(jié)合后其水解速度可提高1萬倍而使P21失活.P21和GDP結(jié)合后可以激活鳥苷酸釋放蛋白（GNRP),GNRP使P21釋放GDP結(jié)合GTP，因此通過GTP和GDP的相互轉(zhuǎn)化可以有節(jié)制地調(diào)節(jié)P21對信號系統(tǒng)的開啟和關(guān)閉，完成生長分化信號傳入細(xì)胞內(nèi)的過程.

Ras蛋白在合成后，需要經(jīng)過兩種方式翻譯后修飾，才可定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè).①通過FTase在Ras蛋白羧基端的CAAX四肽結(jié)構(gòu)中的Cys殘基上加上一個類異戊二烯基團法尼基，隨后AAX殘基從C端上斷裂脫落，法尼基化Cys

羧甲基化，此修飾使RasC端具有疏水性；②N2或H2ras的 半胱氨酸 的S2酰基化，長鏈的S2?；〈箁as具有疏水性.有研究表明，激活ras的表達能增強血管生長因子（例如VEGF/VPF）的表達，提示Ras蛋白在 血管生成 中發(fā)揮作用，抑制Ras蛋白活性能抑制依賴Ras蛋白的腫瘤細(xì)胞增殖，也能干擾血管生成.同時，激活Ras蛋白還能抑制凋亡.Ras蛋白過度表達還能增加藥物和紫外光誘導(dǎo)的凋亡，可能的機制是 ras癌基因 增強了細(xì)胞分解 過氧化氫 的能力從而抑制凋亡.然而，這個假說還需進一步研究.

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4.1 ras基因激活的方式

作為原癌基因的ras基因被激活以后就變成有致癌活性的癌基因.ras基因激活的方式有3種：基因點突變，基因大量表達，基因插入及轉(zhuǎn)位.其中ras基因被激活最常見的方式就是點突變，多發(fā)生在N端第12,13和61密碼子，其中又以第12密碼子突變最常見，而且多為GGT突變成GTT.不同突變位點對P21的活化機制不同，第12密碼子突變可以減弱P21內(nèi)在的GTP酶活性，并使細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞間接觸抑制減弱；第61密碼子突變可削弱GAP對P21的內(nèi)在GTP酶活性，并可減弱GAP與P21結(jié)合的穩(wěn)定性.

4.2 ras基因突變致癌的機制

ras基因激活構(gòu)成癌基因，其表達產(chǎn)物Ras蛋白發(fā)生構(gòu)型改變，功能也隨之改變，與GDP的結(jié)合能力減弱，和GTP結(jié)合后不需外界生長信號的刺激便自身活化.此時Ras蛋白內(nèi)在的GTP酶活性降低，或影響了GTP的活性，使Ras蛋白和GTP解離減少，失去了GTP與GDP的有節(jié)制的調(diào)節(jié)，活化狀態(tài)的Ras蛋白持續(xù)地激活PLC產(chǎn)生第二信使，造成細(xì)胞不可控制地增殖，惡變.同時細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞間接觸抑制增強也加速了這一過程.

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Ras2MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

5.1 Ras上游通路

Ras能被復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)激活.首先，被磷酸化激活的受體如PDGFR,EGFR直接結(jié)合 生長因子受體 結(jié)合蛋白（Grb2），這些受體也可以間接結(jié)合并磷酸化含有src同源區(qū)2(SH2）結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（例如Shc,Syp）后，再激活Grb2.第二，Grb2的src同源區(qū)3(SH3）結(jié)構(gòu)域與靶蛋白如mSos1,mSos2,C3G及發(fā)動蛋白（dynamin）結(jié)合.C3G與連接蛋白Crk的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合后耦聯(lián)酪氨酸磷酸化而激活Ras.Crk也能結(jié)合mSos1激活Ras.Grb2與激活的受體結(jié)合促進鳥苷酸交換因子（Sos）蛋白定位在與Ras相鄰的細(xì)胞膜上.這樣，Sos與Ras形成復(fù)合體，GTP取代GDP與Ras結(jié)合后，Ras被激活，當(dāng)GTP水解成GDP后Ras失活.Ras具有內(nèi)在GTPase活性，它的活性可被RasGAPs調(diào)節(jié)，因而RasGAPs扮演Ras活性調(diào)節(jié)劑的角色.另外，Ras失活也受到高度調(diào)節(jié)。有三種蛋白質(zhì)能水解GTP使Ras失活，它們分別是P120GAP,neurofibromin和GAP1m，統(tǒng)稱為RasGAPs.

5.2 Ras下游通路

5.2.1 Ras/Raf通路

至今，Ras/Raf通路是最明確的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.當(dāng)GTP取代GDP與Ras結(jié)合，Ras被激活后，再激活絲蘇氨酸激酶級聯(lián)放大效應(yīng)，招集細(xì)胞漿內(nèi)Raf1絲蘇氨酸激酶至細(xì)胞膜上，Raf激酶磷酸化MAPK激（MAPKK),MAPKK激活MAPK.MAPK被激活后，轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)，直接激活轉(zhuǎn)錄因子.另外，MAPK刺激Fos,Jun轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄因子AP1，該因子與myc基因旁的特異的DNA序列結(jié)合，從而啟動轉(zhuǎn)錄.myc基因產(chǎn)物也是轉(zhuǎn)錄因子，它能激活其他基因.最終，這些信號集中起來誘導(dǎo)D型Cyclin的表達和活性.D型Cyclin與Cyclin依賴性激酶（如CDK4和CDK6）形成復(fù)合體，該復(fù)合體的形成促使細(xì)胞從G1期進入S期.因此，Ras/Raf通路在受體信號和G1期進展之間起著關(guān)鍵作用.然而，Ras/Raf通路不是調(diào)控G1期進展的惟一通路.Ras與Raf單獨結(jié)合不能促進Raf激酶活性，同時，Raf能被不依賴Ras的機制所激活（例如能被Src酪氨酸激酶和PKC所激活），MAPK也能被不依賴Ras機制（如通過調(diào)節(jié)整合素的活性）所激活.表明級聯(lián)反應(yīng)每一個信號蛋白質(zhì)都能被多個上游蛋白質(zhì)所激活，而它們也可能有另外的靶蛋白.另一個重要的Ras通路效應(yīng)物是Cyc2lin依賴性激酶抑制劑P21Waf1/cip1，它被Ras所誘導(dǎo)，抑制Cdk2CyclinE和Cdk2CyclinA復(fù)合體的活性，從而阻斷DNA的合成.

5.2.2 Rho/Rac通路

Rho家族蛋白質(zhì)是 小G蛋白 的 Ras超家族 成員，其氨基酸序列大約有30%與Ras蛋白相同，三個主要的Rho蛋白是Cdc42,Rho,Rac.Cdc42刺激Rac,Rac接下來刺激Rho.然而，這個直線模型對于精確的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來說過于簡單，因為有證據(jù)顯示交叉聯(lián)系存在，例如Cdc42不通過Rac能影響Rho的活性.下游靶點Rho激酶α的激活，導(dǎo)致肌動蛋白的重新構(gòu)建和P21激活的絲蘇氨基酸激酶參與應(yīng)力纖維的分解.最后Rac和Cdc42利用MAPK傳遞信號至核內(nèi)，Rho通過刺激Src和fos啟動子達到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用.另外，Rac和Cdc42激活JunN端激酶，該酶結(jié)合Jun,EIk1和ATF2等轉(zhuǎn)錄因子，這就是Rho在細(xì)胞癌變過程中起重要作用的可能機制.另一個重要Rho下游靶點是P21Waf1/cip1.Rho抑制P21Waf1/cip1誘導(dǎo)，有利于Ras驅(qū)動細(xì)胞進入S期,P21Waf1/cip1陰性細(xì)胞不需要Rho進行Ras激活的DNA合成，降低了通過誘導(dǎo)P21Waf1/cip1在Ras轉(zhuǎn)化過程中的重要性.

5.3 Ras2MAPK信號途徑與腫瘤的關(guān)系

腫瘤發(fā)生 與調(diào)控 細(xì)胞增殖 的信號發(fā)生異常有關(guān).一些腫瘤病人 生長因子 或其受體的表達或功能出現(xiàn)異常，如卵巢癌病人血清中EGF和 胰島素樣生長因子 含量升高；EGF增高影響細(xì)胞間連接，促進細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤.臨床資料表明， 酪氨酸蛋白激酶受體 過表達與腫瘤相關(guān)，ErbB22在乳癌病人中30%過表達；起源于上皮的肺癌，乳癌等EGFR過表達，并與高轉(zhuǎn)移率，低生存率以及差的預(yù)后相關(guān)，通過降低EGFR表達可抑制EGFR過表達的卵巢癌細(xì)胞的增殖.腫瘤細(xì)胞ras基因突變率大約為25%，而胰腺癌和結(jié)腸癌分別達到85%和40%. ras癌基因 主要以點突變和基因擴增方式存在，突變位點在第11,12,13,18,59,61密碼子，是Ras蛋白和GAP的作用位點，由于突變，抑制了Ras內(nèi)在的GTP酶活性，突變的Ras鎖定在持續(xù)激活的Ras2GTP狀態(tài)，引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化.raf癌基因與人類腫瘤關(guān)系密切，很少突變，但Raf持續(xù)活化，可導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化；在 小細(xì)胞肺癌 病人的組織標(biāo)本中，Raf在mRNA和蛋白水平均過表達，活性增高.在腫瘤治療的研究中，可從以下幾方面阻斷Ras2MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 ：① 酪氨酸蛋白激酶抑制劑 ，如Radici2col抑制V2Ha2ras轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞的MAPK活性，使細(xì)胞表型逆轉(zhuǎn)；新研究的酪氨酸蛋白激酶抑制劑能雙重作用ErbB22和EGFR，廣泛抑制ErbB22或（和）EGFR過表達的腫瘤生長.②抑制Ras法尼基化： 法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 （FTIs）是分子水平抗癌藥，抑制ras翻譯后修飾，已有多種FTIs用于動物模型和臨床前期實驗，有明顯的抗腫瘤作用，如SCH66336對表達高水平H2Ras2GTP和ras是否突變的腫瘤都有生長抑制作用，已進入臨床試驗.③反義核苷酸技術(shù)：C2H2ras 反義RNA 質(zhì)粒降低人胃癌BGC2823細(xì)胞的H2ras表達并抑制細(xì)胞生長和部分惡性表型逆轉(zhuǎn)；Raf21反義DNA抑制人 白血病 細(xì)胞的增殖.④其他：針對 受體酪氨酸激酶 與底物作用的SH2區(qū)或SH3區(qū)設(shè)計多肽，在體外實驗抑制酶和底物結(jié)合.

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6.1 診斷

ras癌基因 和P21在許多癌前病變中都有表達.Ochi等發(fā)現(xiàn)1例胰液中K2ras突變 陽性 而細(xì)胞學(xué)及影像學(xué)檢查均陰性的病例，隨診18個月后才發(fā)現(xiàn)惡性細(xì)胞及影像學(xué)的變化.提示ras基因突變早于病理檢出及臨床表現(xiàn)的出現(xiàn).提示可用檢測ras癌基因或P21的方法對癌變傾向提供較早信息.Kimura等檢測切除的胰腺標(biāo)本中K2ras的突變率，在胰導(dǎo)管癌，胰黏液細(xì)胞癌和慢性胰腺炎中分別是81%,53%和7%，相應(yīng)胰液中的突變率分別為72%,53%和0，所以檢測胰液中突變的K2ras基因即可為 臨床診斷 提供有力的幫助.Futakawa等檢測52例胰腺癌病人胰液中突變的K2ras基因和 癌胚抗原 水平，結(jié)果顯示這兩項指標(biāo)聯(lián)合檢測在胰腺癌診斷中的準(zhǔn)確度是90%，因此可用聯(lián)合檢測的方法及早而準(zhǔn)確地診斷腫瘤.

6.2 病情評估及預(yù)后判斷

Shirakawa等通過檢測P21,P53,Ki67和 細(xì)胞角蛋白 10發(fā)現(xiàn)食管鱗癌的分化程度取決于發(fā)育不良的程度，而P21在這個演化過程中起關(guān)鍵作用.Rak等發(fā)現(xiàn)突變的ras基因可強效刺激 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 的表達.Thebo等對有K2ras12或13密碼子突變的DukesB2期 結(jié)直腸癌 進行分析顯示，80%的原發(fā)灶和局域 淋巴結(jié) 發(fā)生相同位點的ras基因突變，說明ras基因突變對腫瘤 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是高風(fēng)險因素.有文獻報道，唾液腺癌中H2ras基因突變率與臨床病理指標(biāo)呈高度正相關(guān)，可通過檢測基因突變來推測腫瘤所處的階段和分化程度.可見檢測突變的ras基因可為臨床病情的評估提供有力的依據(jù).

Harada等研究表明，P21(-）者5年生存率為64.1%,(+）者為38.0%，⑹者為11.5%,P21是決定生存率的重要而獨立的指標(biāo).但許多文獻報道ras基因突變和臨床病理指標(biāo)及預(yù)后沒有明顯的關(guān)系.聯(lián)合檢測 非小細(xì)胞肺癌 組織中K2ras,p53和cerbB2基因的異常表達，比單項檢測可明顯地提高對預(yù)后的評估，因此，可用聯(lián)合檢測對某種腫瘤較敏感的幾個癌基因的方法來對預(yù)后進行評估.

6.3 治療

研究表明，體外給予結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116/P21+/+)P21 反義寡脫氧核苷酸 ，可提高癌細(xì)胞對放療的敏感性；用末端含CAAX堿基的制劑作用于人類 ras癌基因 轉(zhuǎn)染的 動物細(xì)胞 ，可抑制癌細(xì)胞的生長；用核糖酶（K2rasR2）拮抗突變的K2ras12細(xì)胞系，可使細(xì)胞生長停止，凋亡增加，VEGF 基因表達 受抑.可見用分子生物學(xué)的方法治療腫瘤是有廣闊應(yīng)用前景的.

總之，雖然對ras基因，Ras蛋白及Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究已達一定的深度，ras基因已在臨床有一些應(yīng)用，但仍有許多問題需解決，如ras基因突變發(fā)生在腫瘤形成的那些階段，Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互影響，相互交叉，阻斷單一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能否真正起到改變或影響 腫瘤發(fā)生 發(fā)展的作用等.隨著對這些問題的研究，解決，人們將對腫瘤的預(yù)防，診斷和治療提供更新更有效的方法.

Ras癌基因參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展，最初是在急性轉(zhuǎn)化性逆轉(zhuǎn)錄病毒實驗中從Harvey、Kirsten兩株大鼠肉瘤病毒中克隆出來的轉(zhuǎn)化基因，自1982年Weinberg等人發(fā)現(xiàn)人的膀胱癌細(xì)胞中有活化的H-ras基因后，引起了人們對 ras癌基因 在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用的極大關(guān)注。

ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種——H-ras、K-ras和N-ras，分別定位在11、12和1號染色體上。其中，K-Ras則對人類癌癥影響最大，它好像 分子開關(guān) ：當(dāng)正常時能控制調(diào)控細(xì)胞生長的路徑；發(fā)生異常時，則導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長，并阻止細(xì)胞自我毀滅。

長春花堿為什么能治療癌癥？

長春堿類抗腫瘤藥物系由夾竹桃科植物長春花（Vinca rosea)中提取。本品為細(xì)胞周期特異性藥物，可使腫瘤細(xì)胞的有絲分裂停止于中期，對M期有延緩或陰滯作用，將細(xì)胞殺滅于G1期。與長春新堿（VCR）相同，VLB抗腫瘤作用靶點是微管，與管蛋白二聚體結(jié)合，抑制微管蛋白的聚合，從而妨礙紡錘體微管的形成，使核分裂停止于中期，引起核崩潰、呈空泡狀或固縮。VLB還作用于細(xì)胞膜，干擾細(xì)胞膜對氨基酸的轉(zhuǎn)運，使蛋白蛋合成受到抑制；亦可通過抑制RNA聚合酶的活力而抑制RNA合成。動物實驗證明，本品對多種腫瘤者有抑制作用，較高濃度可直接破壞染色體。 ＊警告＊長春花是夾竹科的植物，折斷其莖葉而流出的白色乳汁，有劇毒，千萬不可誤食！ 含70種以上生物堿，主要有長春堿（vinblastine）、長春新堿（leurocristine）、阿馬里新（ajmalicine）、lochneridine、lochnericine、carharosin等。

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