頂級(jí)科學(xué)家為腫瘤免疫治療潑冷水(腫瘤免疫分型深度剖析好文)

頂級(jí)科學(xué)家為腫瘤免疫治療潑冷水

2016年09月18日訊 作為癌癥治療的新工具，免疫治療為人們帶來(lái)了新希望。如今，這方面的研究正進(jìn)行得如火如荼。不過(guò)，據(jù)STAT網(wǎng)站報(bào)道，在上周召開的第二屆全球癌癥免疫治療大會(huì)上，一些頂級(jí)專家給人們潑了一盤冷水。

華盛頓大學(xué)的Philip Greenberg博士說(shuō)：“別輕信你所聽到的。”他也是著名的免疫治療公司Juno Therapeutics的聯(lián)合創(chuàng)始人。盡管利用免疫系統(tǒng)來(lái)攻擊腫瘤取得了巨大進(jìn)展，但他及實(shí)驗(yàn)室成員認(rèn)為，免疫腫瘤學(xué)不僅僅是刺激T細(xì)胞攻擊腫瘤那么簡(jiǎn)單。

Greenberg表示：“盡管T細(xì)胞圍攻腫瘤，以惡性細(xì)胞上的分子作為攻擊目標(biāo)，但我們也看到了復(fù)發(fā)?！蓖瑫r(shí)，在急性骨髓性白血病的早期臨床試驗(yàn)中，即使患者的免疫系統(tǒng)在攻擊惡性的血細(xì)胞，但其生存率并沒有改善。

他認(rèn)為，在某些病例中，腫瘤變身，使得T細(xì)胞針對(duì)的目標(biāo)消失。當(dāng)T細(xì)胞不攻擊腫瘤細(xì)胞時(shí)，這些癌細(xì)胞又釋放鉀離子，反過(guò)來(lái)摧毀T細(xì)胞，阻止它們攻擊其他的腫瘤細(xì)胞。腫瘤還會(huì)發(fā)出“抑制信號(hào)”，讓T細(xì)胞關(guān)閉。此外，可怕的副作用也仍然是免疫治療的一大挑戰(zhàn)。

文章指出，免疫腫瘤面對(duì)的困難也反映了之前那些“革命性”方法的問(wèn)題。比如，癌癥生物學(xué)家設(shè)法利用藥物來(lái)阻斷腫瘤的血液供應(yīng)，讓它們餓死，這被稱為抗血管生成。但腫瘤很快又想出另一種方法來(lái)增加血液供應(yīng)，致使許多患者復(fù)發(fā)和死亡，而僅僅增加了幾周的生存。

在另一種分子靶向治療技術(shù)中，藥物敲除了那些驅(qū)動(dòng)惡性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的分子。正如宣傳的那樣：藥物禁用了那些驅(qū)動(dòng)生長(zhǎng)的分子，不過(guò)，腫瘤很快又另辟蹊徑，通過(guò)其他的途徑生長(zhǎng)和增殖。

當(dāng)然，免疫治療領(lǐng)域也有一些突破性的成功，如默沙東公司研發(fā)的Keytruda。這是一種單克隆抗體，它通過(guò)阻斷腫瘤表面的PD-1分子與其配體PD-L1的結(jié)合，掐斷PD-1信號(hào)通路，阻止其對(duì)人體內(nèi)免疫T細(xì)胞的抑制。它適用于晚期黑色素瘤的治療。類似的抗癌藥物還有Opdivo和Yervoy。

癌癥生物學(xué)家已經(jīng)意識(shí)到，腫瘤細(xì)胞是以一種非常復(fù)雜的方式應(yīng)對(duì)治療，這往往使最好的想法挫敗。然而，在此次會(huì)議中的1460名科學(xué)家中，有700多名是來(lái)自產(chǎn)業(yè)界，這表明學(xué)術(shù)實(shí)驗(yàn)室中的突破正在迅速商業(yè)化。

盡管有些挫折，但科學(xué)界也表示樂觀。他們認(rèn)為，免疫治療最終將造福許多患者。通過(guò)正視免疫治療如何失敗，研究人員將讓更多患者受益。Greenberg引用了《火星救援》中那位滯留宇航員的話，“我要用科學(xué)干出一條生路。

腫瘤免疫分型深度剖析好文

第一章：腫瘤免疫分型的起源

1.腫瘤免疫分型的由來(lái)

腫瘤的近代治療起源于西方，可從18世紀(jì)算起。而更遠(yuǎn)的腫瘤治療史可追溯到我國(guó)宋代。最早描述癌癥的特征是《仁齋直指附遺方論》一書中 “癌者上高下深，巖穴之狀，顆顆累垂……毒根深藏，穿孔透里” ，意思是說(shuō)腫瘤像巖石狀，有毒根深藏于體內(nèi)，從這句話可以看出那時(shí)對(duì)腫瘤的外觀描述，基本上與現(xiàn)在的腫瘤類似。人類與腫瘤的斗爭(zhēng)已長(zhǎng)達(dá)上千年，而始終沒有取得重大進(jìn)展。這是因?yàn)橄惹皩?duì)腫瘤的研究大多集中在腫瘤細(xì)胞本身，也就是大家所認(rèn)識(shí)的腫瘤生物學(xué)范疇；而隨著醫(yī)療和科研水平的進(jìn)步，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤異質(zhì)性很大，尤其是患者之間更無(wú)從規(guī)律可循，并且腫瘤細(xì)胞可在周圍環(huán)境產(chǎn)生變化之后發(fā)生進(jìn)化，研究腫瘤細(xì)胞本身就變得困難重重。因此直到步入20世紀(jì)，人們才開始認(rèn)識(shí)到要想戰(zhàn)勝腫瘤，我們需要更強(qiáng)大的武器，那就是 人體自身的免疫系統(tǒng) ，這樣的科研導(dǎo)向也就促進(jìn)了腫瘤免疫學(xué)這個(gè)熱門研究領(lǐng)域的發(fā)展。

利用人體免疫系統(tǒng)來(lái)殺傷腫瘤 的方式最開始并不被人們看好，一方面是因?yàn)槔妹庖呦到y(tǒng)治療腫瘤的方式?jīng)]有像手術(shù)、化療那樣立竿見影；另一方面是因?yàn)樽铋_始科學(xué)家對(duì)復(fù)雜的人體免疫系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)并不透徹。隨著人們對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的研究越來(lái)越深入，腫瘤免疫治療近二十年才得以慢慢為世人所接受，其中最為引起轟動(dòng)的是 2018年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了研究腫瘤免疫治療的兩位學(xué)者：Allison和Honjo 。他們分別揭示了免疫檢查點(diǎn)CTLA-4和PD-1在腫瘤中的作用，從而為免疫治療藥物的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

免疫檢查點(diǎn)抑制劑在很多腫瘤中都取得了良好的響應(yīng)，這本應(yīng)該是一個(gè)比較理想的結(jié)局，然而故事并沒有那么簡(jiǎn)單，并且腫瘤的免疫治療之路才剛剛開始。隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑投入到各種腫瘤的大型臨床實(shí)驗(yàn)中，問(wèn)題也越來(lái)越突出，那就是雖然有些腫瘤患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)答很好，但在另外很多腫瘤患者中免疫檢查點(diǎn)抑制劑卻根本沒有任何療效。同樣的抗體，為什么會(huì)出現(xiàn)如此截然不同的結(jié)果？科學(xué)家開始研究導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因。

圖1：

考慮到免疫檢查點(diǎn)抑制劑主要是動(dòng)員自身的免疫細(xì)胞來(lái)攻擊腫瘤，那么很容易就可以想到的是會(huì)不會(huì)因?yàn)榛颊咦陨淼拿庖呒?xì)胞的功能狀態(tài)不同，從而對(duì)免疫治療藥物的應(yīng)答不同呢。方向是有了，但似乎離科學(xué)家想得到的解釋還有點(diǎn)距離。這是因?yàn)槿绻麖恼麄€(gè)機(jī)體的免疫系統(tǒng)出發(fā)，那問(wèn)題就比較復(fù)雜，而且不夠直接，這個(gè)問(wèn)題直到免疫微環(huán)境的提出才得到更好的解決。研究者通過(guò)對(duì)多種腫瘤的腫瘤微環(huán)境分析后發(fā)現(xiàn)， 每一種腫瘤，甚至每一位患者的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞都存在差異 ，于是就有研究者根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的特點(diǎn)將腫瘤大致分為 “冷”腫瘤 和 “熱”腫瘤 ， 前者腫瘤中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞少以及較多比例的是免疫抑制性細(xì)胞（Treg,MDSC），對(duì)免疫治療應(yīng)答反應(yīng)弱；后者腫瘤中浸潤(rùn)著較多的激活性免疫細(xì)胞（CD8+T,Th1），能對(duì)免疫治療藥物產(chǎn)生較好的應(yīng)答反應(yīng)。

2.腫瘤免疫分型分子機(jī)制

“冷”“熱”腫 瘤概念的提出是 腫瘤免疫分型的雛形 ，而如果想進(jìn)一步的理解免疫分型，人們就迫切需要知道究竟是什么原因會(huì)引起不同患者腫瘤免疫微環(huán)境如此大的差異。

眾所周知，人體免疫系統(tǒng)是一個(gè)整體，其包括中樞免疫器官胸腺、骨髓以及外周免疫器官淋巴結(jié)、脾臟等，它們是各種免疫細(xì)胞的駐扎地，還需要淋巴管、血管等完成免疫細(xì)胞到局部組織的運(yùn)輸工作。腫瘤中很少有淋巴管，而血管含量豐富。那是不是腫瘤血管的含量是引起免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的不同呢？答案是否定的，因?yàn)檠茇S富的腫瘤反而浸潤(rùn)更多的抑制性免疫細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。故事說(shuō)到這，就需要一些免疫學(xué)知識(shí)做支撐。 免疫細(xì)胞的定向遷徙除了受血管和淋巴管影響外，還需要一類重要的免疫分子：趨化因子以及趨化因子受體。如果將血管比作馬路， 趨化因子就是信號(hào)燈，它們掌控著各種免疫細(xì)胞的走向 。

圖2：

科學(xué)家通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，正是 腫瘤中各種趨化因子和趨化因子受體的種類以及含量不同，才會(huì)引起不同患者腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的巨大差異 。一些腫瘤細(xì)胞也因此利用免疫系統(tǒng)的這個(gè)特點(diǎn)，從而釋放促進(jìn)抑制性免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的趨化因子，并高表達(dá)對(duì)應(yīng)的趨化因子受體來(lái)吸引抑制性免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而有利于自身的生長(zhǎng)。

第二章：腫瘤免疫分型的全面揭示

1.腫瘤三大免疫分型的提出

腫瘤免疫分型的理念被提出了，但科研不是哲學(xué)，光是理念是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，研究者需要用數(shù)據(jù)說(shuō)話。 腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞腫瘤雖多，但大體可以分為兩種，一種是可以發(fā)揮殺傷腫瘤作用的免疫細(xì)胞，如：NK, NKT, CD8+ T細(xì)胞；另一類則是發(fā)揮抑制免疫細(xì)胞殺傷腫瘤功能的細(xì)胞，如：Treg, Th1, Th2, M1, M2； 這些免疫細(xì)胞中功能最重要的就是T細(xì)胞，因?yàn)闊o(wú)論是何種形式的免疫細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)最后都需要T細(xì)胞的參與，而且目前各種免疫檢查點(diǎn)抑制劑主要也是作用于T細(xì)胞來(lái)發(fā)揮抗腫瘤功能，因此揭示腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞功能是最重要的。

圖3：

對(duì)腫瘤免疫分型的研究有很多，其中 比較受研究者廣泛認(rèn)可的就是腫瘤的三大免疫分型： “免疫浸潤(rùn)型” 、 “免疫排斥型” 、 “免疫沙漠型” 。研究者通過(guò)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)這三類顯著的差異，在“免疫浸潤(rùn)型”腫瘤中，CD8+T細(xì)胞可以浸潤(rùn)到腫瘤內(nèi)部；“免疫排斥型”腫瘤中，雖然也有較高的CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)程度，但都是集中在腫瘤外圍；而“免疫沙漠型”腫瘤中很少有CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。

圖4：

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，“免疫浸潤(rùn)型”腫瘤內(nèi)部表達(dá)較高的 MHCI 類分子 ，而另外兩種類型的腫瘤中卻MHCI分子的表達(dá)情況明顯降低；此外，“免疫排斥型”的腫瘤外圍表達(dá)較高的 細(xì)胞表面糖蛋白絲氨酸蛋白酶(FAP) ，這個(gè)基因主要負(fù)責(zé)塑造細(xì)胞外基質(zhì)，可調(diào)控腫瘤外周形成一層厚厚的基質(zhì)，從而阻斷免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。

2.腫瘤免疫分型的量化

三大腫瘤免疫分型的提出為研究者提供了更加確切的證據(jù)，但同時(shí)也引出一個(gè)問(wèn)題，就是對(duì)于很多患者來(lái)說(shuō)被診斷出腫瘤時(shí)都已經(jīng)是晚期；而且如果對(duì)每一位患者都進(jìn)行組織切片，從而進(jìn)行免疫組化染色來(lái)進(jìn)行腫瘤分型是不切合實(shí)際的。因此，研究者在一個(gè)大型卵巢腫瘤隊(duì)列中將數(shù)字病理和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析進(jìn)行結(jié)合，開發(fā)了一種機(jī)器學(xué)習(xí)方法來(lái)揭示腫瘤的分子分類和描述腫瘤免疫表型。通過(guò)使用隨機(jī)森林的算法，研究者開發(fā)出了一個(gè)基于 157個(gè)特征基因的分類器 ，根據(jù)患者這些基因的表達(dá)情況，對(duì)患者進(jìn)行腫瘤免疫特征分類。

圖5：

3.影響腫瘤免疫分型的分子機(jī)制

“免疫浸潤(rùn)型”的腫瘤細(xì)胞表達(dá)較高水平的MHCI類分子而低表達(dá)FAP基因；而“免疫排斥型”的腫瘤細(xì)胞的MHCI類分子明顯降低卻高表達(dá)FAP基因。那么這兩種機(jī)制有什么關(guān)聯(lián)呢？哪一種才是引起不同腫瘤免疫特征的始動(dòng)因素？研究者通過(guò)分析這兩條路徑的上下游調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn) 無(wú)論是MHCI類分子還是FAP均受一個(gè)重要免疫分子的調(diào)控，那就是 TGFβ 。原來(lái)，腫瘤細(xì)胞為了逃脫T細(xì)胞的攻擊，可以借助腫瘤抑制性免疫細(xì)胞(Treg,M2)產(chǎn)生TGFβ，后者一方面可以和腫瘤細(xì)胞上的受體結(jié)合，下調(diào)MHCI類分子；一方面可以和成纖維細(xì)胞上的受體結(jié)合上調(diào)FAP的表達(dá)，從而產(chǎn)生膠原蛋白形成厚厚的基質(zhì)層包圍在腫瘤周圍，以排斥殺傷性免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。

圖6：

第三章：腫瘤免疫分型的應(yīng)用

說(shuō)完了腫瘤免疫分型的基礎(chǔ)知識(shí)，那么接下來(lái)我就介紹一些最近有關(guān) 腫瘤免疫分型的高分文章 ，希望能起到拋磚引玉的效果，引起大家進(jìn)一步的思考。

應(yīng)用1：m6A分子調(diào)控腫瘤免疫分型

近些年，腫瘤m6A修飾的調(diào)控機(jī)制也是研究的熱門方向。熱點(diǎn)碰撞會(huì)產(chǎn)生怎樣的化學(xué)反應(yīng)呢，下面首先介紹一篇發(fā)表在Molecular Cancer (IF:27.4) 的一篇文章，篇名為：m 6 A regulator -mediated methylation modification patterns and tumor microenvironment in filtration characterization in gastric cancer。

圖7：

在開始講解m6A和腫瘤免疫分型的聯(lián)合分析之前，我先來(lái)介紹一些m6A的背景知識(shí)。這篇文章首先確定了21個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子，包括8個(gè)Writers、2個(gè)Erasers和11個(gè)Readers。圖7介紹的是這些分子的細(xì)胞分布和基本功能，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)m6A是對(duì)RNA的一種可逆的修飾方式，依靠Writers對(duì)RNA進(jìn)行修飾，Readers進(jìn)行m6A修飾信息的讀取，當(dāng)完成特定使命后又可以依靠Erasers對(duì)m6A修飾進(jìn)行刪除。

圖8：

下面開始講解這篇文章的主要內(nèi)容，作者首先根據(jù) m6A調(diào)控因子的表達(dá)對(duì)患者進(jìn)行分類 ，隨后發(fā)現(xiàn)這種分類和腫瘤免疫分型有很高的相似度 。于是作者就研究了腫瘤的m6A修飾和免疫分型的關(guān)系。最后發(fā)現(xiàn)依靠m6A特征基因算出的m6Ascore值在“免疫浸潤(rùn)型”、“免疫排斥型”、“免疫沙漠型”患者中的得分存在明顯差異（圖8A）。隨后在抗PD-L1隊(duì)列（IMvigor210）和抗PD-1隊(duì)列（GSE78220）中，低m6Ascore的患者都具有顯著的臨床療效(圖8B)，并且顯著的延長(zhǎng)了生存率。此外，低m6Ascore患者的PD-L1明顯高表達(dá)，這表明在對(duì)抗PD-1/L1免疫治療中有潛在的反應(yīng)。

總之， 這項(xiàng)研究基于21個(gè)m6A調(diào)節(jié)因子，區(qū)分了三個(gè)不同的m6A甲基化修飾模式，這三種模式具有明顯不同的TME細(xì)胞浸潤(rùn)特性。 并且不同的m6A修飾模式之間的mRNA轉(zhuǎn)錄組差異與m6A和免疫相關(guān)的生物途徑顯著相關(guān)。作者建立了m6A score評(píng)分系統(tǒng)來(lái)評(píng)估每個(gè)胃癌患者的m6A修飾模式，從而在預(yù)測(cè)免疫治療結(jié)果方面具有重要價(jià)值。

應(yīng)用2：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序揭示卵巢癌免疫特征

單細(xì)胞測(cè)序是近幾年興起的一項(xiàng)革命性技術(shù)，它賦予了研究者在單個(gè)細(xì)胞水平研究各種細(xì)胞功能機(jī)制的能力。同樣作為近些年高分文章中的常用技術(shù)，單細(xì)胞測(cè)序揭示腫瘤免疫分型會(huì)有什么樣的驚喜呢，下面我就介紹一篇發(fā)表在Cancer cell (IF:31.7) 雜志上的一篇文章，篇名為：Single-cell dissection of cellular components and interactions shaping the tumor immune phenotypes in ovarian cancer

圖9：

此研究首先對(duì)15名卵巢癌患者的腫瘤樣本進(jìn)行scRNA-seq（圖9A），根據(jù)已知的細(xì)胞類型的標(biāo)記物來(lái)定義細(xì)胞類型。結(jié)果表明，從整體看不同免疫分型的患者腫瘤細(xì)胞差異較大，同一免疫類型的腫瘤細(xì)胞能聚類到一起，不同免疫分型的腫瘤細(xì)胞差異較大（圖9B）；此外，基質(zhì)細(xì)胞（圖9C）和免疫細(xì)胞（圖9D）類型雖然在患者之間轉(zhuǎn)錄層面差異不大，但其相對(duì)分布情況差異很大，并且與腫瘤的免疫分型并沒有明確關(guān)聯(lián)。

文章進(jìn)一步研究了腫瘤內(nèi)在特征是否影響免疫浸潤(rùn)模式。分析結(jié)果顯示，排斥型和浸潤(rùn)型的腫瘤之間沒有顯著的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄差異，但在排斥型和浸潤(rùn)型組合與沙漠型腫瘤之間有29個(gè)基因表達(dá)顯著差異。對(duì)于這個(gè)結(jié)論我認(rèn)為為排斥型和浸潤(rùn)型應(yīng)該也有比較大的差異，只是單細(xì)胞測(cè)序需要制備單細(xì)胞懸液，可能破壞了這種結(jié)構(gòu)。因而，用單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組進(jìn)一步解析這兩種免疫分型下的腫瘤細(xì)胞功能會(huì)更有意義，尤其是揭示免疫排斥型最外周的基質(zhì)細(xì)胞層的特征將會(huì)為治療這類患者提供更直接的參考價(jià)值。

基因集合富集分析顯示，這些基因主要與增殖途徑有關(guān)，它們的鑒定是由三種具有增殖分子亞型的沙漠型腫瘤所驅(qū)動(dòng)的。另一方面，浸潤(rùn)型和排斥型腫瘤細(xì)胞在干擾素應(yīng)答通路中顯著富集，這主要是由編碼主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類和II類加工和呈遞的基因驅(qū)動(dòng)的。此外，文章還觀察到浸潤(rùn)型和排斥型腫瘤細(xì)胞中氧化磷酸化途徑顯著富集。

圖10：

最后，作者為了總結(jié)這些觀察結(jié)果，總結(jié)出了一個(gè)模型，在這個(gè)模型中，不同的成分和腫瘤、免疫和間質(zhì)間的潛在串?dāng)_可能會(huì)形成不同的腫瘤免疫表型（圖10）。模型中，TME中有免疫功能的腫瘤(包括浸潤(rùn)型和排斥型腫瘤)有許多不同于沙漠型腫瘤的共同特征。表達(dá)CX3CR1配體的內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞也可能參與浸潤(rùn)型和排斥型腫瘤中CX3CR1 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的募集。浸潤(rùn)型和排斥型腫瘤之間也存在重要差異。在T細(xì)胞浸潤(rùn)型腫瘤中，浸潤(rùn)程度可能受到兩個(gè)因素的影響：浸潤(rùn)型腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出CXCL16的高表達(dá)，這可能與CXCR6+T細(xì)胞向腫瘤上皮的募集有關(guān)；此外，浸潤(rùn)型腫瘤中IL1 CAFs豐富，其可能通過(guò)CXCL12/ 14促進(jìn)CXCR4的表達(dá)從而進(jìn)一步募集T細(xì)胞。

這項(xiàng)研究通過(guò) 對(duì)15個(gè)臨床卵巢癌患者的單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，深入剖析了TME中不同的細(xì)胞、功能表型及其動(dòng)態(tài)相互作用，使腫瘤免疫分型的特征更加豐富。 文章結(jié)果強(qiáng)調(diào)了可能形成腫瘤免疫表型的潛在分子機(jī)制，并可能為改善癌癥免疫治療的臨床獲益提供了治療策略。

總結(jié)和展望

近些年，關(guān)于 腫瘤免疫分型 的機(jī)制探索無(wú)論是在臨床研究還是基礎(chǔ)科學(xué)研究中都是 炙手可熱的方向 ，其產(chǎn)生的研究成果也非常有利于進(jìn)行臨床腫瘤免疫治療藥物的轉(zhuǎn)化。

本文系統(tǒng)的梳理了 腫瘤免疫分型的來(lái)源、發(fā)展和應(yīng)用 ，但只是窺全豹之一斑，仍然有很多細(xì)節(jié)需要大家自行補(bǔ)充。我是做腫瘤免疫基礎(chǔ)研究的，近幾年，發(fā)自內(nèi)心體會(huì)到如今只簡(jiǎn)單的做經(jīng)典的基因功能調(diào)控機(jī)制已很難再?zèng)_擊高分文章，只有著手于具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值的研究成果才能在如今科研浪潮下拔得頭籌，而腫瘤免疫分型的研究正是符合了科研工作者的各種想象。

當(dāng)然如果你并不是想發(fā)高分文章，只是想水幾篇SCI，那么做一些較簡(jiǎn)單的腫瘤免疫分型也是不二選擇。但從2021年已經(jīng)發(fā)表的生信文章中可以看出，我們已很難再見到只分析純腫瘤生物學(xué)特征的文章，將近90%的腫瘤生信思路文章或多或少都會(huì)聯(lián)合免疫特征進(jìn)行分析。如果之前你還不能意識(shí)到這個(gè)問(wèn)題，那么閱讀完此文的你就抓緊學(xué)習(xí)腫瘤免疫分型吧，相信在不久的將來(lái)也能發(fā)表一篇不錯(cuò)的腫瘤免疫分型相關(guān)的SCI論文。

[參考文獻(xiàn)]

Nagarsheth N, Wicha MS, Zou W. Chemokines in the cancer microenvironment and their relevance in cancer immunotherapy.Nat Rev Immunol.2017 Sep;17(9):559-572. doi: 10.1038/nri.2017.49. Epub 2017 May 30.

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如何從腫瘤免疫應(yīng)答的角度設(shè)計(jì)研究思路？

在抗腫瘤免疫應(yīng)答過(guò)程中，藥物的療效很大程度上取決于腫瘤特異的效應(yīng)性免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)，而效應(yīng)細(xì)胞的增殖和活性受免疫檢查點(diǎn)共刺激和共抑制信號(hào)的共同調(diào)節(jié)。因此增加抗腫瘤免疫反應(yīng)往往是通過(guò) 增強(qiáng)作為正向調(diào)節(jié)的共刺激信號(hào)，或阻斷負(fù)向調(diào)節(jié)的抑制信號(hào) 。但往往事情沒有我們想的那么簡(jiǎn)單，尤其是在異質(zhì)性很強(qiáng)的腫瘤微環(huán)境中，各種免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)紛繁復(fù)雜，這也就促使我們采用多種免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合治療的方案。

目前發(fā)現(xiàn)具有可用于藥物治療的免疫檢查點(diǎn)分子有很多： PD-1, PD-L1, CTLA4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, PVRIG, NKG2A 等，因?yàn)镻D-1/PD-L1和CTLA4最早被發(fā)現(xiàn)，也研究的最多，因此目前抗CTLA-4 與抗 PD-1/PD-L1 聯(lián)合策略也被用于多種腫瘤的免疫治療中。但這種組合方式在很多腫瘤患者中的療效并不顯著，還具有很強(qiáng)的副作用，因此近些年科學(xué)家正不斷研究別的免疫檢查點(diǎn)聯(lián)合用藥方式。其中因 TIM-3 廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、Tregs、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DCs、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等各種免疫細(xì)胞，并與 Galectin9 、高遷移率組盒1( HMGB1 )和癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子1( CEACAM-1 )結(jié)合成為了近幾年基礎(chǔ)和臨床研究工作者的青睞。此外，TIM-3與PD-1在耗盡的T細(xì)胞和TILs上的共表達(dá)現(xiàn)象為聯(lián)合使用抗PD-1和抗TIM-3提供了一個(gè)思路。并且一些小鼠模型的實(shí)驗(yàn)為這種組合的有效性提供了直接證據(jù)，幾個(gè)I期的抗PD-1聯(lián)合抗TIM-3的研究已經(jīng)在晚期和轉(zhuǎn)移性實(shí)體腫瘤中開始施行。

那么接下來(lái)我就先通過(guò)解讀今年發(fā)表在 Nat Commun (IF:14.91)一篇名為：Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy的文章介紹免疫檢查點(diǎn)分子情侶PD-1/TIM-3以及 Galectin-9 的三角戀故事。

1.質(zhì)譜分析篩選PD-1的結(jié)合蛋白

研究者首先通過(guò)IP/Western和免疫復(fù)合物的質(zhì)譜分析確定了Galectin-9是PD-1的結(jié)合蛋白，且具有免疫調(diào)節(jié)活性。這里可能大家需要想到作者肯定篩選出了很多可以與PD-1結(jié)合的蛋白，然后通過(guò)實(shí)驗(yàn)逐一進(jìn)行功能驗(yàn)證，最后發(fā)現(xiàn)Galectin-9蛋白具有較好的表型，因此后續(xù)都對(duì)這個(gè)蛋白進(jìn)行分析。 類比這樣的方法我們還可以篩選與自己研究基因相結(jié)合的蛋白，從而縮小靶基因的范圍。 后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明了Galectin-9與PD-1的結(jié)合是高度選擇性的，并且是由多糖介導(dǎo)的，它不影響PD-1與其同源配體PD-L1的結(jié)合，也不影響PD-1和治療性抗體Pembrolizumab和nivolumab的結(jié)合。

Galectin-9主要有兩個(gè)CRD ( N-CRD，C-CRD )結(jié)合位點(diǎn)，研究者發(fā)現(xiàn)Galectin-9主要通過(guò)其 C-CRD 與PD-1結(jié)合，而N-CRD和C-CRD均介導(dǎo)其與Tim-3的結(jié)合。為了確定PD-1上與Galectin-9結(jié)合的糖基化位點(diǎn)，將PD1上4個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)(N49、N58、N74和N116)上的天冬酰胺(N)殘基分別突變?yōu)楣劝滨０?Q)，發(fā)現(xiàn) N116Q 突變?cè)诤艽蟪潭壬嫌绊懥薖D-1與Gal-9的結(jié)合，因此Galectin-9/PD-1的相互作用主要由Gal-9的C-CRD和PD-1的N116連接的糖鏈介導(dǎo)。

圖1：

2. Galectin-9可與PD-1和TIM-3交聯(lián)形成復(fù)合物

緊接著研究者通過(guò)平板蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在沒有Galectin-9的情況下，PD-1 ECD并不結(jié)合TIM-3 ECD，而Galectin-9促進(jìn)了它們的協(xié)同結(jié)合。DuoLink實(shí)驗(yàn)和IP/Western實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。但神奇的是， 在沒有外源Galectin-9的情況下，PD-1/TIM-3相互作用也能被檢測(cè)到 ，這種相互作用并不被乳糖或PD-1 N116Q突變所抑制。這就好比PD-1/TIM-3本來(lái)是一對(duì)情侶，只是感情并不是太穩(wěn)定，這時(shí)生活中出現(xiàn)了一個(gè)和兩人都能處得來(lái)的好友Galectin-9，表面是調(diào)節(jié)二者關(guān)系，其實(shí)是和其中一人搞曖昧。

圖2：

3. Galectin-9可作為癌癥免疫治療的靶點(diǎn)

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析,研究者發(fā)現(xiàn) Galectin-9誘導(dǎo)的T細(xì)胞死亡可能與抗癌免疫抑制有關(guān) ，因此研究者評(píng)估了抑制Galectin-9在癌癥治療中的潛力，并推測(cè)這可能是由于抑制Galectin-9后T細(xì)胞共刺激受損所致。接下來(lái)，通過(guò)將抗Galectin-9與 GITR (TNFRSF共刺激受體家族的一個(gè)成員)的激動(dòng)型抗體DTA-1相結(jié)合驗(yàn)證了這一想法，它們的組合在不同的腫瘤模型中協(xié)同抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和延長(zhǎng)了總生存期。因此，這些結(jié)果表明Galectin-9是腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)，并且抗Galectin-9聯(lián)合GITR激動(dòng)劑可以誘導(dǎo)出強(qiáng)大的抗腫瘤活性。

圖3：

4. 質(zhì)譜流式證實(shí)抗Galectin-9治療針對(duì)特定的腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞亞群

只有推測(cè)，沒有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)當(dāng)然是不行的，研究者接下來(lái)就在荷瘤小鼠中進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)分析幾組質(zhì)譜流式的結(jié)果，研究者發(fā)現(xiàn)抑制Galectin-9可以選擇性地?cái)U(kuò)大了瘤內(nèi)TIM-3+ CD8T和CD4T細(xì)胞亞群，這也包括具有免疫抑制性的Treg細(xì)胞， 并且Treg細(xì)胞在總CD45+TIL中的比例增加 ，特別是CD8T細(xì)胞中CD8T_1亞群的比例在抗Galectin-9處理后增加了兩倍以上。由于Treg可以特異性的抑制抗腫瘤免疫，因此接著通過(guò)聯(lián)合使用抗Galectin-9和抗GITR（可特異下調(diào)Treg）后，CD8T亞群的比例進(jìn)一步增加，而Treg細(xì)胞幾乎完全喪失。因此，抗Galectin-9單一療法雖然擴(kuò)增了具有效應(yīng)潛能的CD8T細(xì)胞亞群。然而，它的治療效果可能會(huì)因?yàn)門reg細(xì)胞的共同擴(kuò)增而受到影響。

圖4：

一般情況下，CD8T細(xì)胞在腫瘤抗原的不斷刺激下會(huì)逐漸失去功能，變成衰竭前體細(xì)胞。在這個(gè)階段的CD8T細(xì)胞會(huì)高表達(dá)TCF1，同時(shí)也表達(dá)PD-1,TIM-3，如果腫瘤抗原持續(xù)存在，CD8T細(xì)胞就會(huì)走向終末衰竭的T細(xì)胞，并且逐漸走向死亡。但是處在這個(gè)終末衰竭性T細(xì)胞狀態(tài)前的T細(xì)胞可以被抗Galectin-9治療給逆轉(zhuǎn)成具有較強(qiáng)增殖和分化能力的功能性T細(xì)胞，只不過(guò)同時(shí)擴(kuò)增的還有Treg細(xì)胞。因此，聯(lián)合使用抗GITR來(lái)控制Treg細(xì)胞的擴(kuò)增則解決了這一難題。

圖5：

5.單細(xì)胞數(shù)據(jù)揭示Galectin-9的表達(dá)分布

其實(shí)講到這，文章的主體研究思路都講完了，但是為了進(jìn)一步解析Galectin-9在各類免疫細(xì)胞的表達(dá)情況，作者還分析了之前發(fā)表的一套單細(xì)胞數(shù)據(jù)。所以，這也進(jìn)一步說(shuō)明了數(shù)據(jù)挖掘的重要性。無(wú)論是多高級(jí)的研究思路，都是需要大數(shù)據(jù)作為支撐才變得更有說(shuō)服力，這個(gè)數(shù)據(jù)可以來(lái)源于自己花錢測(cè)的，也可以來(lái)自已經(jīng)發(fā)表的研究。這里作者就通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)Galectin-9(LGALS9)在多種免疫細(xì)胞中都有表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)與對(duì)PD-1治療沒有應(yīng)答的患者相比，應(yīng)答患者表達(dá)更高水平的Galectin-9,這也證實(shí)了抗Galectin-9和抗PD-1聯(lián)合用藥的可能性。

圖6：

6.關(guān)于免疫應(yīng)答研究可做的生信思路

好了，上面介紹了如何通過(guò) 實(shí)驗(yàn)研究 免疫檢查點(diǎn)分子間的互作關(guān)系從而探索影響腫瘤免疫治療應(yīng)答的因素，學(xué)習(xí)了一些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的研究策略。然而，為了符合我一貫寫作的氣質(zhì)，下面得對(duì)應(yīng)來(lái)點(diǎn)別的有深意的生信干貨。其實(shí)作為數(shù)據(jù)挖掘的熱點(diǎn)，有關(guān)腫瘤對(duì)免疫治療應(yīng)答的相關(guān)生信思路有很多，下面主要列舉幾篇今年剛發(fā)表的研究免疫治療應(yīng)答的文章思路:

圖7：

第一篇解讀的是發(fā)表在Mol Ther Oncolytics（IF:7.20）雜志上篇名為“Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8 + T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma”的文章。作者重新分析了已經(jīng)發(fā)表的黑色素瘤單細(xì)胞數(shù)據(jù)，揭示出來(lái)7群CD8 T細(xì)胞亞群，這些亞群具有不一樣的特征。此外，作者還鑒定出了3個(gè)在衰竭性CD8 T細(xì)胞上過(guò)表達(dá)的基因(PMEL, TYRP1和EDNRB)，它們與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。像這種思路，只要有數(shù)據(jù)都能很容易的復(fù)現(xiàn)一篇，至于發(fā)到什么樣的雜志上，就看證實(shí)的發(fā)現(xiàn)是否新穎。

圖8：

另一篇發(fā)表在 J Immunother Cancer （IF:13.75）篇名為：CXCL13 shapes immunoactive tumor microenvironment and enhances the efficacy of PD-1 checkpoint blockade in high-grade serous ovarian cancer的文章則是從影響免疫浸潤(rùn)的趨化因子著手。這個(gè)思路主要是對(duì)明星分子在不同癌型中的功能進(jìn)行探索，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行功能驗(yàn)證。因?yàn)槊餍欠肿颖谎芯康暮芏嗔?，除非做泛癌分析，否則基本上很難做出太新穎的東西。但是這類實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)很簡(jiǎn)單，只需要證明某個(gè)明星分子在 特定的癌型 中通過(guò)何種方式影響免疫治療反應(yīng)即可。

圖9：

如果覺得明星分子沒有太多研究新意，當(dāng)然還可以通過(guò)各種生信方法篩選出關(guān)鍵基因。接下來(lái)一篇發(fā)表在 Oncoimmunology （IF:8.11）的篇名為“YKT6, as a potential predictor of prognosis and immunotherapy response for oral squamous cell carcinoma, is related to cell invasion, metastasis, and CD8+ T cell infiltration”的文章就是先通過(guò) WGCNA 的方法篩選出和免疫抑制相關(guān)的基因YKT6，進(jìn)行后續(xù)的分析。對(duì)于這種新篩出的之前沒有報(bào)道過(guò)的基因就比較容易說(shuō)故事，當(dāng)然這個(gè)思路有一些運(yùn)氣的成分，很有可能百費(fèi)周折篩選出的基因要么沒有很好的功能，要么就已經(jīng)被報(bào)道。

圖10：

如果你腫瘤免疫的生物學(xué)背景知識(shí)不強(qiáng)，也沒有很好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，那么還有最后一種選擇，那就是萬(wàn)能膏藥之臨床預(yù)測(cè)模型。最后一篇發(fā)表在 Front Immunol （IF:7.56）雜志上，篇名為“9-Gene Signature Correlated With CD8 + T Cell Infiltration Activated by IFN-γ: A Biomarker of Immune Checkpoint Therapy Response in Melanoma”的文章就是通過(guò)構(gòu)建和免疫治療相關(guān)的臨床預(yù)測(cè)模型。有關(guān)臨床預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建，現(xiàn)在已經(jīng)很成熟了，如 LASSO,COX,NMF 等模型都可以套用。這個(gè)思路前提是需要找一個(gè)較為新穎切入點(diǎn)，且最后能被多套數(shù)據(jù)集驗(yàn)證出來(lái)，那就基本可以發(fā)表一點(diǎn)不錯(cuò)的SCI文章了。

7.小結(jié)

本文從研究腫瘤免疫治療應(yīng)答的這個(gè)科學(xué)問(wèn)題著手，先是通過(guò)一篇以實(shí)驗(yàn)為主的研究型文章解讀了如何通過(guò)巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出有潛力的免疫檢查點(diǎn)分子，隨后分別解讀了一些純生信和生信聯(lián)合實(shí)驗(yàn)的文章思路。有關(guān)腫瘤免疫治療問(wèn)題可以研究的方向有很多，但是 一般需要先了解研究癌型的免疫治療進(jìn)展 ，有的問(wèn)題在一些癌型中已經(jīng)被研究的很通透，那就沒有必要再去浪費(fèi)時(shí)間了，而同樣的科學(xué)問(wèn)題在一些腫瘤中就還是一個(gè)未知，那這樣的問(wèn)題就比較有研究的價(jià)值了。此外，就像開頭說(shuō)的因?yàn)槊庖咧委煈?yīng)答與否牽扯的問(wèn)題主要和免疫細(xì)胞的比例有關(guān)，而免疫細(xì)胞在腫瘤中的占比不高，因此bulk測(cè)出來(lái)的高表達(dá)基因主要是腫瘤細(xì)胞自身的基因，從這個(gè)角度看基于 bulk數(shù)據(jù)差異分析找出的高表達(dá)基因需要用腫瘤細(xì)胞系去做實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 。而單細(xì)胞數(shù)據(jù)就比較利于揭示免疫細(xì)胞上表達(dá)和免疫治療的基因，但是商品化的10X平臺(tái)可測(cè)得的基因不多，我的經(jīng)驗(yàn)是先從單細(xì)胞數(shù)據(jù)揭示各種免疫細(xì)胞的比例，找出應(yīng)答和非應(yīng)答的差異免疫細(xì)胞亞群，從而進(jìn)一步找出高表達(dá)的基因，最后通過(guò)簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)進(jìn)行免疫細(xì)胞的功能驗(yàn)證就基本都可以發(fā)表一篇不錯(cuò)的生信文章了。

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