簡單小竅門
，將CRISPR-Cas9基因編輯效率提高5倍

夕陽紅 2024-06-06 20:42:30

簡單小竅門，將CRISPR-Cas9基因編輯效率提高5倍

2016年08月19日訊加州大學(xué)伯克利分校的研究人員現(xiàn)在找到了一種方法，可在大多數(shù)類型的人類細(xì)胞中將CRISPR-Cas9切割及讓基因喪失功能的效率提高5倍，使得構(gòu)建及研究基因敲除細(xì)胞系變得更容易

，并有潛力讓突變基因喪失功能作為一種人類療法。

科學(xué)家們在不斷地發(fā)現(xiàn)新基因或它們編碼的蛋白，但要闡明它們在體內(nèi)或疾病中的作用則難得多

。發(fā)現(xiàn)這一作用的關(guān)鍵在于要讓基因喪失功能，看看當(dāng)除去它時(shí)會發(fā)生什么

。

，將CRISPR-Cas9基因編輯效率提高5倍.png" />

盡管CRISPR-Cas9可以加速生成基因敲除細(xì)胞系的過程，研究人員有時(shí)必須制造并篩查這一遺傳剪刀的許多變體來找到能夠很好地起作用的CRISPR-Cas9

。加州大學(xué)伯克利分校的研究人員發(fā)現(xiàn)進(jìn)行簡單的調(diào)整

，可以將這一過程的效率提高許多倍。

關(guān)鍵是將不與人類基因組中任何DNA序列匹配的一些DNA短片段，與CRISPR-Cas9蛋白一起導(dǎo)入到細(xì)胞中

。這些稱作為寡核苷酸的DNA短片段似乎干擾了細(xì)胞中的DNA修復(fù)機(jī)制

，將普通CRISPR-Cas9s的編輯性能提高了2.5-5倍。

首席研究員

、加州大學(xué)創(chuàng)新基因組計(jì)劃科學(xué)主任

、分子與細(xì)胞生物學(xué)副教授Jacob Corn說：“事實(shí)證明，如果你做件非常簡單的事--只是供給細(xì)胞在人類基因組中任何地方?jīng)]有同源性的

、廉價(jià)的合成寡核苷酸

，編輯率將提高5倍?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">！边@一技術(shù)可以提高所有CRISPR-Cas9s的效率

，甚至是那些最初根本無法發(fā)揮作用的CRISPR-Cas9。

獲得更高的效率

，研究人員將能夠更成功地構(gòu)建出他們想要的基因敲除細(xì)胞系

，隨后利用它們來探索一個基因或一組基因的功能。因?yàn)榇蠖鄶?shù)長壽細(xì)胞系都來源于癌細(xì)胞

，包括非常受歡迎的HeLa細(xì)胞系

，這些細(xì)胞系的每個基因通常具有超過正常兩個以上的拷貝。這使得難于同時(shí)敲除所有的拷貝

，更高的效率大大提高了成功的機(jī)會

。

當(dāng)要敲除基因糾正人體內(nèi)的遺傳突變時(shí)高效率也很重要。醫(yī)生們一直在考慮敲除使得人們?nèi)菀最净几腥拘约膊?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">，如艾滋病

，或自身免疫、炎癥或神經(jīng)退行性疾病的一些基因

。Corn和同事們描述的這種方法是否能夠用于治療仍有待觀察

，但它對于實(shí)現(xiàn)研究目的非常有效。

CRISPR-Cas9分子是由一個蛋白質(zhì)剪刀Cas9蛋白

，和告訴Cas9結(jié)合與切割DNA位置的地址所構(gòu)成

。這一技術(shù)依賴于，當(dāng)你切割DNA時(shí)細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制并不總是能正確重建DNA鏈

，而是在讓基因喪失功能

，破壞其活性的序列中生成了一個錯誤。

地址是由20個核酸分子構(gòu)成

，與靶基因DNA序列互補(bǔ)的向?qū)NA

。這一向?qū)NA像一條尼龍搭扣那樣結(jié)合DNA，導(dǎo)致了Cas9切割雙鏈DNA

。

自加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna和于默奧大學(xué)的Emmanuelle Charpentier在2012年發(fā)明這一技術(shù)以來

，一些向?qū)NAs能夠很好地起作用

，導(dǎo)致Cas9近100%切割基因并讓其喪失功能，而另一些結(jié)合但卻很少或根本不敲除基因的原因一直是個謎

。Corn說

，切割效率隨細(xì)胞類型和特定細(xì)胞系而異。

Corn懷疑

，Cas9偶然不良的切割效率可能與DNA的修復(fù)方式有關(guān)

，因?yàn)榧?xì)胞間DNA的修復(fù)機(jī)制有差異。他推斷

，與人類DNA非同源的任意DNA鏈或許可以擾亂修復(fù)過程

，提高基因敲除成功率。

Corn將CRISPR-Cas9基因編輯描繪為是切割與DNA修復(fù)之間的一場競爭：在Cas9切割DNA后

，細(xì)胞會精確地替換切割DNA

，Cas9再度切割DNA，在無休止的切割和修復(fù)循環(huán)中直至修復(fù)酶生成一個錯誤

，基因最終功能失常

。或許

，寡核苷酸降低了修復(fù)過程的保真度

，或讓細(xì)胞切換至更易出錯的一種修復(fù)，使得Cas9能夠更為容易地打斷基因

。

Corn說，下一個前沿是利用DNA修復(fù)的一些特性

，提高序列插入

，用正常的基因來替換缺陷基因，并有可能治愈一種遺傳性疾病

。

CRISPR/Cas系統(tǒng)可以構(gòu)建出多個基因精確突變的小鼠

，但其效率低下阻礙了生成足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)基因小鼠來建立人類疾病模型。通過添加一種抗癌藥物Scr7到遺傳編輯的受精卵中

，Whitehead研究所的科學(xué)家將CRISPR/Cas的效率顯著提高了19倍

。

通過將CRISPR/Cas9系統(tǒng)注入到受精卵中，可一步構(gòu)建出攜帶單基因或多基因突變或獲得其他遺傳改造的小鼠

。盡管這一技術(shù)是有效的

，但它需要進(jìn)行顯微注射--只能一次對一個受精卵實(shí)施這一有著一定技術(shù)難度且耗時(shí)的操作。在發(fā)表于2015年6月《Genetics》雜志上的一篇研究論文中

，研究人員證實(shí)電穿孔是一種可替代顯微注射的更快

、更高通量的策略。

來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院

、上?div id="4qifd00" class="flower right">

？萍即髮W(xué)的研究人員報(bào)告稱

，在大鼠中他們通過抑制非同源末端連接（NHEJ）以及利用Cas9蛋白提高了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的精確基因組編輯的效率。這一研究成果發(fā)布在2016年5月10日的RNA Biology雜志上

。

CRISPR: 基因編輯原理及應(yīng)用

CRISPR的全稱Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

，意為成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列，Cas則是CRISPR-associated (Cas) systems

。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是原核生物的免疫系統(tǒng)

，這個系統(tǒng)可以識別出外源 DNA，并將它們切斷

，沉默外源基因的表達(dá)

，用來抵抗外源遺傳物質(zhì)比如噬菌體病毒和外源質(zhì)粒的入侵。這與真核生物中RNA干擾（RNAi）的原理是相似的

。正是由于這種精確的靶向功能

，CRISPR/Cas 系統(tǒng)被開發(fā)成一種高效的基因編輯工具。在自然界中

，CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有多種類別

，其中 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是研究最深入，應(yīng)用最成熟的一種類別

。

CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 來識別并剪切 DNA 以降解外來核酸分子?div id="m50uktp" class="box-center"> ，F(xiàn)在使用的 CRISPR/cas 9 系統(tǒng)是由最簡單的 type II CRISPR 改造而來，該系統(tǒng)由單鏈的 guide RNA 和有核酸內(nèi)切酶活性的 Cas 9 蛋白構(gòu)成

。

??nature video視頻： CRISPR: 基因編輯原理及應(yīng)用

基因敲除：sgRNA+Cas9
基因敲入：sgRNA+Cas9+目的基因（HDR模版）

5‘端開始數(shù)20個堿基這一段是需要設(shè)計(jì)的

，這一段用來識別目的基因上的靶標(biāo)，并通過堿基互補(bǔ)配對原理與靶點(diǎn)位置結(jié)合

。
gRNA再往后數(shù)76個堿基

，是另一段transactiviting RNA (tracrRNA)。它的序列是一定的

，就像轉(zhuǎn)運(yùn)RNA一樣可以形成空間結(jié)構(gòu)

，然后就可以和Cas9酶相結(jié)合。
這樣一條完整的gRNA就可以識別靶點(diǎn)

，并且把與它自身結(jié)合的Cas9酶帶到這個靶點(diǎn)

，引導(dǎo)Cas9酶在靶點(diǎn)處對目的基因的雙鏈DNA進(jìn)行切斷，從而達(dá)到基因編輯的目的

。

目前又很多在線工具可以用于設(shè)計(jì)sgRNA

不同的導(dǎo)入方式基因標(biāo)記效率和脫靶效率不同

參考：
CRISPR實(shí)驗(yàn)究竟怎么做

？手把手教給你
CRISPR/Cas9 基因編輯全套操作和解決方案（TAKARA 講解）

本文地址:http://m.mcys1996.com/jiankang/303805.html.

聲明： 我們致力于保護(hù)作者版權(quán)，注重分享