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生物芯片技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用

醫(yī)案日記 2023-06-18 20:57:36

生物芯片技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用

生物芯片技術(shù)是近年來(lái)生命科學(xué)與微電子學(xué)相互交叉滲透發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新技術(shù)

。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃(HGP)研究的不斷突破
,這門(mén)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因診斷
、功能基因研究、基因組文庫(kù)圖型分析
、新藥的研究與開(kāi)發(fā)、法醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域
。生物芯片技術(shù)主要通過(guò)平面微細(xì)加工技術(shù)構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)
,以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)
、核酸及其它生物組分的準(zhǔn)確
、快速、大信息量檢測(cè)
,具有高度平行性
、多樣性、微型化和自動(dòng)化的特點(diǎn)
。常用的芯片有基因芯片和蛋白質(zhì)芯片兩大類(lèi)
,多數(shù)為前者(DNA芯片)的寡核苷酸微陣列
。它以分析核酸中的堿基序列特征為基礎(chǔ),通過(guò)對(duì)受檢者的某一特定基因和其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分析測(cè)定而對(duì)某種疾病進(jìn)行診斷
,使醫(yī)學(xué)診斷方法從當(dāng)今的生化
、免疫、病原學(xué)診斷躍升到一個(gè)新的臺(tái)階
。它特異性強(qiáng)
、靈敏度高,可對(duì)疾病進(jìn)行早期診斷
,更利于疾病防治?div id="4qifd00" class="flower right">
,F(xiàn)將近年的應(yīng)用情況介紹如下。

用于遺傳性疾病的監(jiān)測(cè)

隨著HGP的逐步完成

,許多遺傳性疾病的相關(guān)基因被相繼定位
,為從基因水平上認(rèn)識(shí)本類(lèi)疾病并為早期診斷奠定了基礎(chǔ)。如血友病
、苯丙酮尿癥
、地中海貧血、老年癡呆癥
、亨廷頓舞蹈癥
、某些精神病等的致病基因已定位,因此可將對(duì)應(yīng)于突變熱點(diǎn)區(qū)的寡核苷酸探針合成或點(diǎn)加于DNA芯片上
,通過(guò)一次雜交完成對(duì)待測(cè)樣品多種突變可能性的篩查
,實(shí)現(xiàn)對(duì)多種遺傳病的高效快速診斷。國(guó)外現(xiàn)已成功地將這一技術(shù)用于β-珠蛋白基因的突變檢測(cè)以診斷地中海貧血
,其高準(zhǔn)確性及高自動(dòng)化特性有望成為診斷這一疾病的常規(guī)技術(shù)

用于腫瘤診斷

基于癌基因的激活和抑癌基因的失活參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,因此對(duì)此類(lèi)基因的突變進(jìn)行檢測(cè)已成為腫瘤診斷的重要手段

。目前
,生物芯片當(dāng)之無(wú)愧已成為最方便的檢測(cè)工具。對(duì)遺傳性乳腺癌和卵巢癌的相關(guān)基因的外顯子檢測(cè)已可證實(shí)93%以上的病人存在基因的點(diǎn)突變
、插入與缺失突變等
,且可快速準(zhǔn)確掃描大量基因,適于大量患者的標(biāo)本檢測(cè)
,對(duì)臨床基因診斷至關(guān)重要
。國(guó)外運(yùn)用寡核苷酸微陣列技術(shù)檢測(cè)卵巢癌者的TP53突變,準(zhǔn)確率達(dá)94%
,敏感度達(dá)92%
,特異性達(dá)100%,明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的DNA測(cè)序分析。有人以cDNA消減文庫(kù)結(jié)合交通量微陣列檢測(cè)前列腺癌和前列腺組織特異基因發(fā)現(xiàn)
,P504S是一種前列腺癌的特異基因
,檢測(cè)其含量消長(zhǎng)可指導(dǎo)臨床診斷與治療。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)
,人類(lèi)所患癌癥50%以上為P53基因突變所致
,研究人員將此基因全長(zhǎng)序列和已知突變的探針制成了P53基因芯片,并制備出能同時(shí)檢測(cè)250種腫瘤相關(guān)基因的芯片
,將在癌癥的早期診斷中發(fā)揮重要作用

用于病毒性疾病的診斷

將各種病毒的特異性序列制成探針,有序地點(diǎn)陣到芯片上再與處理后的樣本進(jìn)行雜交

,一次就可檢測(cè)出多種病毒并能鑒定出亞型
。對(duì)HIV-1β亞型中的逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因的多態(tài)性分析揭示,這一亞型的病毒基因序列存在極大差異
,其中蛋白酶的基因片段差異最大
,在編碼的99個(gè)氨基酸序列中,竟有47.5%存在明顯突變
,直接導(dǎo)致了病毒抗藥性的不同
。國(guó)外現(xiàn)已有用于HIV-1的測(cè)序分型及多態(tài)性分析的試劑盒問(wèn)世。國(guó)內(nèi)也已研制出了檢測(cè)丙肝病毒(HCV)的基因芯片
,敏感性高
、分辨率好,準(zhǔn)確性接近100%
。用芯片對(duì)人巨細(xì)胞病毒(HCIV)感染后引起的細(xì)胞基因表達(dá)改變情況的分析已發(fā)現(xiàn)
,感染前后有258種mRNA水平改變大于4倍,其中一些mRNA編碼的基因產(chǎn)物在病毒致病性中起關(guān)鍵作用

在其它疾病診斷中的應(yīng)用

這一技術(shù)已成功用于幽門(mén)螺旋桿菌(HP)的基因診斷、基因結(jié)構(gòu)分析和基因分型

,已成為HP研究及臨床研究的有力武器
。國(guó)外將等溫的基因擴(kuò)增與微陣列分析結(jié)合,用于細(xì)菌病原體間的鑒別
。細(xì)菌的rRNA在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中變化不大
,在堿基組成、堿基序列
、高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能等不同層次均有保守性
,因此此類(lèi)生物芯片可快速準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌,用于檢測(cè)特異性病原微生物
、毒性標(biāo)記物及抗藥微生物的抗藥性基因
,比培養(yǎng)及傳統(tǒng)檢測(cè)方法更快、更敏感
、更特異
。芯片技術(shù)還用于分枝桿菌對(duì)利福平等藥物的耐藥性研究
、檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎等疾病的相關(guān)基因等等
,為許多疾病的診斷和治療提供了新的思路

生物芯片盡管有諸多其它檢測(cè)方法難以比擬的優(yōu)越性,但因問(wèn)世與使用時(shí)間較短

,目前仍有一定的局限性影響到其應(yīng)用
。這些局限性表現(xiàn)在:技術(shù)成本高,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)
,不利于普及推廣
;探針制備、合成過(guò)程要求嚴(yán)格
,若摻入錯(cuò)誤核苷酸或混入雜質(zhì)
,使雜交背景增高,其特異性將大大降低
;對(duì)雜交條件的選擇要求很高
,一個(gè)芯片上多種探針的最適條件頗不一致,增大了芯片的制作難度及測(cè)定誤差等等
。但是這一技術(shù)具有巨大理論價(jià)值和實(shí)用性能
,其發(fā)展前景十分廣闊。人們預(yù)計(jì)
,在未來(lái)的幾年內(nèi)上述不足將能很快得以解決
,芯片上探針位點(diǎn)的空間分辨率將達(dá)到1微米水平,人類(lèi)所有的約3萬(wàn)個(gè)基因有望集成在一塊1平方厘米的芯片之上

DMSO在藥物合成中的應(yīng)用

鬼臼亞乙苷(etoposide)是p53活化拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅱ的抑制劑

,在臨床上作為一種抗腫瘤藥物。Wang 等經(jīng)用鬼臼亞已苷作用人成骨肉瘤細(xì)胞系U2- OS后
,根據(jù)不同的時(shí)間間隔分別提取細(xì)胞mRNA
,用寡核苷酸芯片測(cè)定6591條mRNA表達(dá)百的變化,發(fā)現(xiàn)62條mRNA表達(dá)縣有變化
。通過(guò)選取其中12條基因做進(jìn)一步研究
,發(fā)現(xiàn)有2條是已知的 p53調(diào)控基因(WAF1/p21和PCNA),有兩條是新的p53靶基因
,其余的與p53無(wú)關(guān)
。在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,他們提出了介導(dǎo)鬼臼亞乙苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)途徑
。此項(xiàng)研究工作使人們又多獲得一種抗腫痛藥物的靶點(diǎn)

應(yīng)用DNA芯片還可直接篩選特定的基因文庫(kù)以尋找藥物的作用靶點(diǎn)。如給酵母某一特定的呈單倍體狀態(tài)的基因?qū)?yīng)的位置上放置一個(gè)遺傳標(biāo)記,該標(biāo)記可被DNA芯片所識(shí)別
,那么通過(guò)比較藥物作用前后用芯片檢測(cè)整個(gè)文庫(kù)的結(jié)果
,便有可能獲得藥物作用的靶基因。研究者稱(chēng)此種篩選方式為 haploinsufficiency drug screen

用DNA微陣列芯片進(jìn)行藥物研究還存在如下一些缺點(diǎn):①由于雜交樣品制備復(fù)雜
,采用DNA微陣列芯片很難實(shí)現(xiàn)高通量。②DNA微陣列芯片只能用于檢測(cè)已知序列的基因
。③由于靈敏度的限制
,采用現(xiàn)存的DNA微陣列芯片難以檢測(cè)到表達(dá)水平很低的基因。
除了DNA芯片外
,組織芯片
、蛋白質(zhì)芯片和細(xì)胞芯片也在藥物研究中嶄露頭角。最近
,耶魯大學(xué)的研究小組首次報(bào)道了真核生物蛋白質(zhì)組水平的蛋白質(zhì)微陣列芯片
。他們表達(dá)和純化了酵母的 5800種蛋白質(zhì),并將這些蛋白質(zhì)點(diǎn)樣固定在載玻片上
,制作了酵母蛋白質(zhì)組微陣列芯片
。他們使用這種芯片篩選能與特定蛋白質(zhì)和磷脂相互作用蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)了新的能與鈣調(diào)蛋白和磷脂相互作用的蛋白質(zhì)
。這種蛋白質(zhì)微陣列芯片可以用于篩選與蛋白質(zhì)相互作用的藥物
,還可以用于檢測(cè)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。他們的研究成果證實(shí)了制作和使用蛋白質(zhì)組微陣列芯片進(jìn)行功能分析檢測(cè)的可行性
,并向人們預(yù)示了蛋白質(zhì)微陣列芯片在藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景

Zlauddin和Sabatinl發(fā)明了一種細(xì)胞微陣列芯片。他們首先將不同的質(zhì)粒DNA點(diǎn)在玻璃片上
,做成質(zhì)粒DNA做陣列芯片
。接著用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑處理該質(zhì)粒DNA微陣列芯片,然后在處理好的質(zhì)粒DNA微陣列上培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞
。點(diǎn)在芯片上的質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)染試劑的幫助下原位轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞
,在質(zhì)粒DNA微陣列的每一個(gè)質(zhì)粒樣品點(diǎn)的相同位置形成了轉(zhuǎn)染了該質(zhì)粒的細(xì)胞群。細(xì)胞因獲得了外源DNA而獲得了新的性狀
。這樣,由質(zhì)粒DNA芯片制成了由不同性狀細(xì)胞組成的細(xì)胞做陣列芯片
。他們嘗試用這種細(xì)胞芯片來(lái)確證藥物作用靶點(diǎn)
,尋找能改變細(xì)胞生理狀態(tài)的基因產(chǎn)物。這種新型細(xì)胞芯片可以用來(lái)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高通量篩選有可能成為候選先導(dǎo)分子的化合物
、蛋白質(zhì)或寡核苷酸
。在功能基因組研究和藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。
2 生物芯片作為超高通量篩選平臺(tái)的應(yīng)用
在過(guò)去的十幾年里,隨著科學(xué)的進(jìn)步以及在巨大的經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下
,藥物篩選技術(shù)得到了飛速的發(fā)展
。在80年代中期(高通量篩選形成之初),每天只能篩選30種化合物
,到90年代中期
,每天可篩選1,500種化合物
,而如今每天可篩選超過(guò) 100
,000個(gè)化合物。高速
、低成本的高通量篩選已成為當(dāng)今藥物篩選的主流
,并逐漸向超高通量方向發(fā)展。在過(guò)去的幾年中
,世界上著名的制藥公司紛紛與以高通量藥物篩選技術(shù)為核心的中小型生物科技公司結(jié)盟或合作
,采用高通量或超高通量藥物篩選技術(shù)進(jìn)行先導(dǎo)物分子的篩選。要進(jìn)一步提高篩選率
,高通量篩選技術(shù)的各個(gè)方面均需要技術(shù)創(chuàng)新
,這為生物芯片技術(shù)進(jìn)入藥物篩選領(lǐng)域提供了寶貴的契機(jī)。
提高藥物篩選的通量
,實(shí)現(xiàn)超高通量篩選有2 條途徑:一是微型化
,一是自動(dòng)化。生物芯片作為一種新型技術(shù)平臺(tái)
,正可滿(mǎn)足超高通量篩選微型化和自動(dòng)化的需要
。生物芯片技術(shù)應(yīng)用于超高通量篩選有2個(gè)發(fā)展方向:一是微孔板/微陣列技術(shù),一是微流體芯片技術(shù)

微孔板/微陳列技術(shù)
微孔板技術(shù)的發(fā)展主要表現(xiàn)在板孔數(shù)的增加
。目前,使用最多的是96孔及384孔板
,也有人使用1536孔
、3456孔、甚至 9600孔板
。如Oldenburg等報(bào)道了用9600孔板(0.2μL/孔)分析系統(tǒng)
,以金屬蛋白酶為靶,對(duì)組合及分離純化的化合物庫(kù)進(jìn)行篩選的結(jié)果
。雖然隨著材料科學(xué)和加工技術(shù)的發(fā)展
,微孔板技術(shù)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步,但其發(fā)展面臨著一些不易解決的困難
,主要有:微量液體極易蒸發(fā)
,不適于那些不能用二甲亞砜(DMSO)作溶劑的篩選方法以及受限于當(dāng)今還不夠完善的微量液體分配技術(shù)

微陣列技術(shù)是將微孔板技術(shù)進(jìn)一步微型化。最近
,哈佛大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)了化合物微陣列芯片
,主要用于篩選能與特定蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的化合物。他們將玻片表面進(jìn)行化學(xué)處理
,使其衍生化產(chǎn)生活性基團(tuán)
,然后將溶于有機(jī)溶劑中的化合物用機(jī)械手點(diǎn)在經(jīng)處理的玻片表面,化合物與玻片表面的活性基團(tuán)反應(yīng)而被固定于玻片表面
,這樣就將不同的化合物排布成微陣列
,固定在玻片表面,制成化合物微陣列芯片
。隨后將感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記
,然后與微陣列芯片上的化合物反應(yīng),經(jīng)清洗后
,再進(jìn)行熒光檢測(cè)就可以篩到能與這種蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的化合物
。他們用化合物微陣列芯片進(jìn)行了原理性實(shí)驗(yàn),其結(jié)果表明
,使用這種化合物微陣列芯片可以并行
、快速地進(jìn)行大規(guī)模的化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合篩選。他們最先是將玻璃片表面進(jìn)行馬來(lái)酰亞胺衍生化處理
,后來(lái)采用亞硫酰氯處理
,都獲得了成功。他們還嘗試了使用這種化合物微陣列芯片進(jìn)行大規(guī)模對(duì)映異構(gòu)體的分型檢測(cè)
。加利福尼亞大學(xué)Davis分校的科學(xué)家們采用類(lèi)似的方法也制造了一種化合物微陣列芯片
。他們對(duì)玻琥載玻片表面進(jìn)行氨基化處理,在氨基玻片上進(jìn)行乙醛酰衍生化
,然后將帶有連接臂的配體分子點(diǎn)在修飾過(guò)的玻片表面
。在進(jìn)行化學(xué)連接反應(yīng)之后,這種固定了不同小分子配體的微陣列芯片被用來(lái)進(jìn)行了3種生物學(xué)檢測(cè):蛋白質(zhì)結(jié)合檢測(cè)
、功能磷酸化檢測(cè)和活細(xì)胞粘附檢測(cè)
。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了化合物微陣列芯片可以幫助我們對(duì)由組合合成方法獲得的大量化合物進(jìn)行快速的功能分析和篩選?div id="4qifd00" class="flower right">
;衔镂㈥嚵行酒夹g(shù)與基于微珠體的固相組合會(huì)成技術(shù)相結(jié)合為高通量藥物篩選帶來(lái)了一條新的途徑
,將對(duì)高通量藥物篩選技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生積極的影響。
最近
,出現(xiàn)了一種被稱(chēng)為芯片膜片鉗(patch-on- a-chip)的新技術(shù)
。在這種膜片鉗芯片上加工有檢測(cè)電信號(hào)的點(diǎn)陣,點(diǎn)陣中的每一個(gè)點(diǎn)是一個(gè)電信號(hào)記錄單元
,同時(shí)每個(gè)點(diǎn)底部與負(fù)歷相通
,可以吸位細(xì)胞。這樣膜片鉗芯片上的每一個(gè)點(diǎn)就可以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)的功能
。膜片鉗芯片具有操作簡(jiǎn)單
、快速和可實(shí)現(xiàn)高通量等優(yōu)點(diǎn),可以用于電生理研究和高通量藥物篩選
。位于美國(guó)圣地亞哥的AVIVA公司正在致力于此項(xiàng)技術(shù)的開(kāi)發(fā)

哪些現(xiàn)代生物技術(shù)可以用來(lái)檢測(cè)環(huán)境

生物酶技術(shù)

、金標(biāo)免疫速測(cè)技術(shù)、FCR技術(shù)
、生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)
、生物芯片技術(shù)和生物傳感器。其中生物芯片技術(shù)和生物傳感器應(yīng)用最為廣泛

生物芯片是將生命科學(xué)研究中所涉及的不連續(xù)的分析過(guò)程如樣品制備
、化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè) ,利用微電子
、微機(jī)械
、化學(xué)、物理技術(shù)
、計(jì)算機(jī)技術(shù)在固體芯片表 面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)
,使之連續(xù)化、集成化
、微型化
。生物芯片技術(shù)有四大要點(diǎn):芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備
、生物分子反應(yīng)和信號(hào)的檢測(cè)
。生物芯片的成熟和應(yīng)用一方面將為本世紀(jì)的疾病診斷和治療、新藥開(kāi)發(fā)
、分子生物學(xué)
、航空航天、司法鑒定
、食品衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)革命
;另一方面生物芯片的出現(xiàn)為人類(lèi)提供了能夠?qū)€(gè)體生物信息進(jìn)行高速、并行采集和分析的強(qiáng)有力的技術(shù)手段
,故必將成為未來(lái)生物信息學(xué)研究中的一個(gè)重要信息采集和處理平臺(tái)
。 在環(huán)境保護(hù)上,基因芯片也有廣泛的用途
,一方面可以快速檢測(cè)污染微生物或有機(jī)化合物對(duì)環(huán)境
、人體
、動(dòng)植物的污染和危害,同時(shí)還可用于農(nóng)業(yè)
、商檢
、司法等領(lǐng)域的實(shí)用化芯片的開(kāi)發(fā)。
生物傳感器是一種將生物敏感元件和物理元件相結(jié)合制成的分析儀器
。其基本原理是將生物敏感元件發(fā)生的特異性反應(yīng)及信號(hào)經(jīng)由物理元件轉(zhuǎn)變?yōu)楣?div id="jfovm50" class="index-wrap">、電、聲等易檢測(cè)信號(hào)
,從而間接地獲知待測(cè)物的有關(guān)信息
。生物傳感器在環(huán)境檢測(cè)中的具體應(yīng)用有BOD生物傳感器測(cè)定水環(huán)境、微生物傳感器快速測(cè)定酚
、陰離子表面活性劑傳感器測(cè)定LAS濃度
、硝酸鹽微生物傳感器測(cè)定水體硝酸鹽、微生物傳感器測(cè)定大氣各組分
、殘留有毒有害物的檢測(cè)和污染物急性毒性的檢測(cè)等等

(以前有人問(wèn)過(guò)···········)

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安全使用甲硝唑
近年來(lái)甲硝唑在臨床的應(yīng)用愈來(lái)愈廣泛
,不僅用于滴蟲(chóng)病和阿米巴病的治療
,還進(jìn)一步用于慢性胃炎、潰瘍病的根除幽門(mén)螺桿菌治療
基因檢測(cè)結(jié)果可能影響乳腺癌患者對(duì)手術(shù)方案的選擇
《中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào)》報(bào)道
,最近
,美國(guó)的研究人員提出,新近確診為乳腺癌的女性患者
小兒腎炎
疾病概述小兒腎炎一般指腎小球腎炎
,是一種雙側(cè)腎臟的彌漫性、非化膿性疾病
。多發(fā)生于學(xué)齡兒童
更年心是怎么回事?
更年心是怎么回事?近20年來(lái)
,更年期綜合征幾乎成了醫(yī)學(xué)上一個(gè)時(shí)髦的診斷。不少45~55歲的中年婦女
,因心慌
、失眠多夢(mèng)、潮熱
、煩躁