生物芯片技術在臨床診斷中的應用

生物芯片技術在臨床診斷中的應用

生物芯片技術是近年來生命科學與微電子學相互交叉滲透發(fā)展起來的一門新技術。隨著人類基因組計劃（HGP）研究的不斷突破，這門技術已廣泛應用于基因診斷、功能基因研究、基因組文庫圖型分析、新藥的研究與開發(fā)、法醫(yī)學等諸多領域。生物芯片技術主要通過平面微細加工技術構建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質、核酸及其它生物組分的準確、快速、大信息量檢測，具有高度平行性、多樣性、微型化和自動化的特點。常用的芯片有基因芯片和蛋白質芯片兩大類，多數(shù)為前者（DNA芯片）的寡核苷酸微陣列。它以分析核酸中的堿基序列特征為基礎，通過對受檢者的某一特定基因和其轉錄產物進行分析測定而對某種疾病進行診斷，使醫(yī)學診斷方法從當今的生化、免疫、病原學診斷躍升到一個新的臺階。它特異性強、靈敏度高，可對疾病進行早期診斷，更利于疾病防治?，F(xiàn)將近年的應用情況介紹如下。

用于遺傳性疾病的監(jiān)測

隨著HGP的逐步完成，許多遺傳性疾病的相關基因被相繼定位，為從基因水平上認識本類疾病并為早期診斷奠定了基礎。如血友病、苯丙酮尿癥、地中海貧血、老年癡呆癥、亨廷頓舞蹈癥、某些精神病等的致病基因已定位，因此可將對應于突變熱點區(qū)的寡核苷酸探針合成或點加于DNA芯片上，通過一次雜交完成對待測樣品多種突變可能性的篩查，實現(xiàn)對多種遺傳病的高效快速診斷。國外現(xiàn)已成功地將這一技術用于β－珠蛋白基因的突變檢測以診斷地中海貧血，其高準確性及高自動化特性有望成為診斷這一疾病的常規(guī)技術。

用于腫瘤診斷

基于癌基因的激活和抑癌基因的失活參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，因此對此類基因的突變進行檢測已成為腫瘤診斷的重要手段。目前，生物芯片當之無愧已成為最方便的檢測工具。對遺傳性乳腺癌和卵巢癌的相關基因的外顯子檢測已可證實93％以上的病人存在基因的點突變、插入與缺失突變等，且可快速準確掃描大量基因，適于大量患者的標本檢測，對臨床基因診斷至關重要。國外運用寡核苷酸微陣列技術檢測卵巢癌者的TP53突變，準確率達94％，敏感度達92％，特異性達100％，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的DNA測序分析。有人以cDNA消減文庫結合交通量微陣列檢測前列腺癌和前列腺組織特異基因發(fā)現(xiàn)，P504S是一種前列腺癌的特異基因，檢測其含量消長可指導臨床診斷與治療。目前人們已經發(fā)現(xiàn)，人類所患癌癥50％以上為P53基因突變所致，研究人員將此基因全長序列和已知突變的探針制成了P53基因芯片，并制備出能同時檢測250種腫瘤相關基因的芯片，將在癌癥的早期診斷中發(fā)揮重要作用。

用于病毒性疾病的診斷

將各種病毒的特異性序列制成探針，有序地點陣到芯片上再與處理后的樣本進行雜交，一次就可檢測出多種病毒并能鑒定出亞型。對HIV－1β亞型中的逆轉錄酶和蛋白酶基因的多態(tài)性分析揭示，這一亞型的病毒基因序列存在極大差異，其中蛋白酶的基因片段差異最大，在編碼的99個氨基酸序列中，竟有47.5％存在明顯突變，直接導致了病毒抗藥性的不同。國外現(xiàn)已有用于HIV－1的測序分型及多態(tài)性分析的試劑盒問世。國內也已研制出了檢測丙肝病毒（HCV）的基因芯片，敏感性高、分辨率好，準確性接近100％。用芯片對人巨細胞病毒（HCIV）感染后引起的細胞基因表達改變情況的分析已發(fā)現(xiàn)，感染前后有258種mRNA水平改變大于4倍，其中一些mRNA編碼的基因產物在病毒致病性中起關鍵作用。

在其它疾病診斷中的應用

這一技術已成功用于幽門螺旋桿菌（HP）的基因診斷、基因結構分析和基因分型，已成為HP研究及臨床研究的有力武器。國外將等溫的基因擴增與微陣列分析結合，用于細菌病原體間的鑒別。細菌的rRNA在長期的進化過程中變化不大，在堿基組成、堿基序列、高級結構及功能等不同層次均有保守性，因此此類生物芯片可快速準確地鑒定細菌，用于檢測特異性病原微生物、毒性標記物及抗藥微生物的抗藥性基因，比培養(yǎng)及傳統(tǒng)檢測方法更快、更敏感、更特異。芯片技術還用于分枝桿菌對利福平等藥物的耐藥性研究、檢測類風濕性關節(jié)炎、腸炎等疾病的相關基因等等，為許多疾病的診斷和治療提供了新的思路。

生物芯片盡管有諸多其它檢測方法難以比擬的優(yōu)越性，但因問世與使用時間較短，目前仍有一定的局限性影響到其應用。這些局限性表現(xiàn)在：技術成本高，對實驗條件要求嚴，不利于普及推廣；探針制備、合成過程要求嚴格，若摻入錯誤核苷酸或混入雜質，使雜交背景增高，其特異性將大大降低；對雜交條件的選擇要求很高，一個芯片上多種探針的最適條件頗不一致，增大了芯片的制作難度及測定誤差等等。但是這一技術具有巨大理論價值和實用性能，其發(fā)展前景十分廣闊。人們預計，在未來的幾年內上述不足將能很快得以解決，芯片上探針位點的空間分辨率將達到1微米水平，人類所有的約3萬個基因有望集成在一塊1平方厘米的芯片之上。

DMSO在藥物合成中的應用

鬼臼亞乙苷（etoposide）是p53活化拓撲異構酶 Ⅱ的抑制劑，在臨床上作為一種抗腫瘤藥物。Wang 等經用鬼臼亞已苷作用人成骨肉瘤細胞系U2－ OS后，根據不同的時間間隔分別提取細胞mRNA，用寡核苷酸芯片測定6591條mRNA表達百的變化，發(fā)現(xiàn)62條mRNA表達縣有變化。通過選取其中12條基因做進一步研究，發(fā)現(xiàn)有2條是已知的 p53調控基因（WAF1／p21和PCNA），有兩條是新的p53靶基因，其余的與p53無關。在實驗基礎上，他們提出了介導鬼臼亞乙苷誘導細胞凋亡的信號傳導途徑。此項研究工作使人們又多獲得一種抗腫痛藥物的靶點。
應用DNA芯片還可直接篩選特定的基因文庫以尋找藥物的作用靶點。如給酵母某一特定的呈單倍體狀態(tài)的基因對應的位置上放置一個遺傳標記，該標記可被DNA芯片所識別，那么通過比較藥物作用前后用芯片檢測整個文庫的結果，便有可能獲得藥物作用的靶基因。研究者稱此種篩選方式為 haploinsufficiency drug screen。
用DNA微陣列芯片進行藥物研究還存在如下一些缺點：①由于雜交樣品制備復雜，采用DNA微陣列芯片很難實現(xiàn)高通量。②DNA微陣列芯片只能用于檢測已知序列的基因。③由于靈敏度的限制，采用現(xiàn)存的DNA微陣列芯片難以檢測到表達水平很低的基因。
除了DNA芯片外，組織芯片、蛋白質芯片和細胞芯片也在藥物研究中嶄露頭角。最近，耶魯大學的研究小組首次報道了真核生物蛋白質組水平的蛋白質微陣列芯片。他們表達和純化了酵母的 5800種蛋白質，并將這些蛋白質點樣固定在載玻片上，制作了酵母蛋白質組微陣列芯片。他們使用這種芯片篩選能與特定蛋白質和磷脂相互作用蛋白質，發(fā)現(xiàn)了新的能與鈣調蛋白和磷脂相互作用的蛋白質。這種蛋白質微陣列芯片可以用于篩選與蛋白質相互作用的藥物，還可以用于檢測蛋白質翻譯后的修飾。他們的研究成果證實了制作和使用蛋白質組微陣列芯片進行功能分析檢測的可行性，并向人們預示了蛋白質微陣列芯片在藥物開發(fā)領域的廣闊應用前景。
Zlauddin和Sabatinl發(fā)明了一種細胞微陣列芯片。他們首先將不同的質粒DNA點在玻璃片上，做成質粒DNA做陣列芯片。接著用脂質轉染試劑處理該質粒DNA微陣列芯片，然后在處理好的質粒DNA微陣列上培養(yǎng)哺乳動物細胞。點在芯片上的質粒DNA在轉染試劑的幫助下原位轉染哺乳動物細胞，在質粒DNA微陣列的每一個質粒樣品點的相同位置形成了轉染了該質粒的細胞群。細胞因獲得了外源DNA而獲得了新的性狀。這樣，由質粒DNA芯片制成了由不同性狀細胞組成的細胞做陣列芯片。他們嘗試用這種細胞芯片來確證藥物作用靶點，尋找能改變細胞生理狀態(tài)的基因產物。這種新型細胞芯片可以用來在哺乳動物細胞內高通量篩選有可能成為候選先導分子的化合物、蛋白質或寡核苷酸。在功能基因組研究和藥物開發(fā)等領域具有很大的應用潛力。
2 生物芯片作為超高通量篩選平臺的應用
在過去的十幾年里，隨著科學的進步以及在巨大的經濟利益驅使下，藥物篩選技術得到了飛速的發(fā)展。在80年代中期（高通量篩選形成之初），每天只能篩選30種化合物，到90年代中期，每天可篩選1，500種化合物，而如今每天可篩選超過 100，000個化合物。高速、低成本的高通量篩選已成為當今藥物篩選的主流，并逐漸向超高通量方向發(fā)展。在過去的幾年中，世界上著名的制藥公司紛紛與以高通量藥物篩選技術為核心的中小型生物科技公司結盟或合作，采用高通量或超高通量藥物篩選技術進行先導物分子的篩選。要進一步提高篩選率，高通量篩選技術的各個方面均需要技術創(chuàng)新，這為生物芯片技術進入藥物篩選領域提供了寶貴的契機。
提高藥物篩選的通量，實現(xiàn)超高通量篩選有2 條途徑：一是微型化，一是自動化。生物芯片作為一種新型技術平臺，正可滿足超高通量篩選微型化和自動化的需要。生物芯片技術應用于超高通量篩選有2個發(fā)展方向：一是微孔板/微陣列技術，一是微流體芯片技術。
微孔板/微陳列技術
微孔板技術的發(fā)展主要表現(xiàn)在板孔數(shù)的增加。目前，使用最多的是96孔及384孔板，也有人使用1536孔、3456孔、甚至 9600孔板。如Oldenburg等報道了用9600孔板（0.2μL/孔）分析系統(tǒng)，以金屬蛋白酶為靶，對組合及分離純化的化合物庫進行篩選的結果。雖然隨著材料科學和加工技術的發(fā)展，微孔板技術有了長足的進步，但其發(fā)展面臨著一些不易解決的困難，主要有：微量液體極易蒸發(fā)，不適于那些不能用二甲亞砜（DMSO）作溶劑的篩選方法以及受限于當今還不夠完善的微量液體分配技術。
微陣列技術是將微孔板技術進一步微型化。最近，哈佛大學的研究人員開發(fā)了化合物微陣列芯片，主要用于篩選能與特定蛋白質特異性結合的化合物。他們將玻片表面進行化學處理，使其衍生化產生活性基團，然后將溶于有機溶劑中的化合物用機械手點在經處理的玻片表面，化合物與玻片表面的活性基團反應而被固定于玻片表面，這樣就將不同的化合物排布成微陣列，固定在玻片表面，制成化合物微陣列芯片。隨后將感興趣的蛋白質進行熒光標記，然后與微陣列芯片上的化合物反應，經清洗后，再進行熒光檢測就可以篩到能與這種蛋白質特異性結合的化合物。他們用化合物微陣列芯片進行了原理性實驗，其結果表明，使用這種化合物微陣列芯片可以并行、快速地進行大規(guī)模的化合物與蛋白質的結合篩選。他們最先是將玻璃片表面進行馬來酰亞胺衍生化處理，后來采用亞硫酰氯處理，都獲得了成功。他們還嘗試了使用這種化合物微陣列芯片進行大規(guī)模對映異構體的分型檢測。加利福尼亞大學Davis分校的科學家們采用類似的方法也制造了一種化合物微陣列芯片。他們對玻琥載玻片表面進行氨基化處理，在氨基玻片上進行乙醛酰衍生化，然后將帶有連接臂的配體分子點在修飾過的玻片表面。在進行化學連接反應之后，這種固定了不同小分子配體的微陣列芯片被用來進行了3種生物學檢測：蛋白質結合檢測、功能磷酸化檢測和活細胞粘附檢測。實驗結果證實了化合物微陣列芯片可以幫助我們對由組合合成方法獲得的大量化合物進行快速的功能分析和篩選?；衔镂㈥嚵行酒夹g與基于微珠體的固相組合會成技術相結合為高通量藥物篩選帶來了一條新的途徑，將對高通量藥物篩選技術的發(fā)展產生積極的影響。
最近，出現(xiàn)了一種被稱為芯片膜片鉗（patch-on- a－chip）的新技術。在這種膜片鉗芯片上加工有檢測電信號的點陣，點陣中的每一個點是一個電信號記錄單元，同時每個點底部與負歷相通，可以吸位細胞。這樣膜片鉗芯片上的每一個點就可以實現(xiàn)傳統(tǒng)膜片鉗技術的功能。膜片鉗芯片具有操作簡單、快速和可實現(xiàn)高通量等優(yōu)點，可以用于電生理研究和高通量藥物篩選。位于美國圣地亞哥的AVIVA公司正在致力于此項技術的開發(fā)。

哪些現(xiàn)代生物技術可以用來檢測環(huán)境？

生物酶技術、金標免疫速測技術、FCR技術、生物發(fā)光檢測技術、生物芯片技術和生物傳感器。其中生物芯片技術和生物傳感器應用最為廣泛。
生物芯片是將生命科學研究中所涉及的不連續(xù)的分析過程如樣品制備、化學反應和分析檢測 ，利用微電子、微機械、化學、物理技術、計算機技術在固體芯片表 面構建的微流體分析單元和系統(tǒng)，使之連續(xù)化、集成化、微型化。生物芯片技術有四大要點：芯片方陣的構建、樣品的制備、生物分子反應和信號的檢測。生物芯片的成熟和應用一方面將為本世紀的疾病診斷和治療、新藥開發(fā)、分子生物學、航空航天、司法鑒定、食品衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測等領域帶來一場革命；另一方面生物芯片的出現(xiàn)為人類提供了能夠對個體生物信息進行高速、并行采集和分析的強有力的技術手段，故必將成為未來生物信息學研究中的一個重要信息采集和處理平臺。 在環(huán)境保護上，基因芯片也有廣泛的用途，一方面可以快速檢測污染微生物或有機化合物對環(huán)境、人體、動植物的污染和危害，同時還可用于農業(yè)、商檢、司法等領域的實用化芯片的開發(fā)。
生物傳感器是一種將生物敏感元件和物理元件相結合制成的分析儀器。其基本原理是將生物敏感元件發(fā)生的特異性反應及信號經由物理元件轉變?yōu)楣?、電、聲等易檢測信號，從而間接地獲知待測物的有關信息。生物傳感器在環(huán)境檢測中的具體應用有BOD生物傳感器測定水環(huán)境、微生物傳感器快速測定酚、陰離子表面活性劑傳感器測定LAS濃度、硝酸鹽微生物傳感器測定水體硝酸鹽、微生物傳感器測定大氣各組分、殘留有毒有害物的檢測和污染物急性毒性的檢測等等。
（以前有人問過···········）

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