重視β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)研究

近年來研究發(fā)現(xiàn)，同一品種不同廠家的產(chǎn)品、同一品種不同批號的產(chǎn)品，有的易發(fā)生過敏反應(yīng)，有的則不易發(fā)生過敏反應(yīng)。也就是說，藥物的質(zhì)量直接影響著過敏反應(yīng)的發(fā)生率。研究表明，過敏反應(yīng)的發(fā)生率與藥品中高分子雜質(zhì)的含量密切：相關(guān)高分子雜質(zhì)的含量越低，過敏反應(yīng)的發(fā)生率也就越低；高分子雜質(zhì)的含量越高，過敏反應(yīng)的發(fā)生率也就越高。

高分子雜質(zhì)是主要過敏原

目前，我國科研人員經(jīng)過深入的研究，已從頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢他啶等四種第三代頭孢菌素中分離收集到了能引發(fā)動物過敏反應(yīng)的基本無抗菌活性的聚合物。利用動物口服主動過敏反應(yīng)模型，確證引發(fā)青霉素V鉀、阿莫西林等口服青霉素過敏反應(yīng)的主要過敏原是它們的高分子雜質(zhì)，而頭孢菌素和青霉素本身并不引發(fā)過敏反應(yīng)，腸道吸收不會影響其過敏特性。因此，在研制生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素過程中，必須對其中的高分子雜質(zhì)進(jìn)行研究，以指導(dǎo)優(yōu)化制備工藝、確定適宜的貯藏條件和使用方法，并嚴(yán)格控制其含量，以減少臨床過敏反應(yīng)的發(fā)生。隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的不斷改進(jìn)和提高，目前產(chǎn)品中外源性雜質(zhì)日趨減少，對內(nèi)源性聚合物的控制是當(dāng)前抗生素藥物高分子雜質(zhì)控制的重點。

凝膠色譜法具明顯優(yōu)勢

高分子雜質(zhì)的分離分析方法主要有：反相色譜法、離子交換色譜法和凝膠色譜法（分子排阻色譜法）。由于結(jié)構(gòu)不同的高分子雜質(zhì)通常具有相似的生物學(xué)特性（過敏性），因此在藥品質(zhì)量控制中一般只需控制藥品中高分子雜質(zhì)的總量而不必控制不同結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)。因此，根據(jù)樣品分子量差異進(jìn)行分離的凝膠色譜法則具有明顯的優(yōu)勢。

凝膠色譜法（分子排阻色譜法）是根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。藥物分子進(jìn)入凝膠孔徑內(nèi)部，而高分子雜質(zhì)則被排阻在外，在色譜過程中不被保留，最早被洗脫出來，保留時間較短，而藥物被保留，保留時間較長。

根據(jù)β-內(nèi)酰胺類抗生素和其高分子雜質(zhì)的分子量，研究人員比較了數(shù)種凝膠介質(zhì)，最后選用SephadexG-10作為β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)分離色譜系統(tǒng)的凝膠介質(zhì)，發(fā)現(xiàn)SephadexG-10排阻分子量在1000道爾頓左右。

凝膠色譜方法驗證的內(nèi)容主要有：系統(tǒng)適用性試驗（理論板數(shù)、拖尾因子、精密度和分離度等）、對照溶液的線性、對照溶液的精密度（RSD）、最低檢測限與定量限、F值的重現(xiàn)性、聚合物測定結(jié)果的重現(xiàn)性等。

β-內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)具有高度的不均一性和不確定性，故無法制備對照品，不能采用對照品法定量。中國藥品生物制品檢定所金少鴻等研究者，根據(jù)β-內(nèi)酰胺類抗生素在不同離子強度的介質(zhì)中具有不同表現(xiàn)狀態(tài)的性質(zhì)，首次建立了凝膠色譜自身對照外標(biāo)法定量測定β-內(nèi)酰胺類抗生素中的聚合物。此方法已經(jīng)載入《中國藥典》2000年版和2005年版，用于國產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類抗生素的質(zhì)量控制，并已被國內(nèi)外β-內(nèi)酰胺類抗生素生產(chǎn)廠家廣泛使用。

質(zhì)控研究中存在問題

目前，β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)質(zhì)量控制研究中存在著一些問題，應(yīng)引起注意：因某些β-內(nèi)酰胺類抗生素在特定條件下不能完全締合，無法采用“自身”對照外標(biāo)法定量，故不再繼續(xù)進(jìn)行研究；系統(tǒng)適用性試驗不符合要求，例如，對照溶液與藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時間不一致，對照溶液峰不能重疊或峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差大于5.0%，分離度不符合要求等；對照品制備方法錯誤，如采用在溶液狀態(tài)下加熱或紫外光照射的方法制備β-內(nèi)酰胺類抗生素聚合物對照品；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中聚合物的限度較寬，無科研依據(jù)。

四方面值得關(guān)注

目前，β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)的控制研究有四方面的問題須引起藥品研制、生產(chǎn)人員的關(guān)注。

*高分子雜質(zhì)影響因素

首先要從產(chǎn)品的制備工藝和分子結(jié)構(gòu)特點分析可能產(chǎn)生的高分子雜質(zhì)，并研究溫度、光照、水分及溶液pH值等對高分子雜質(zhì)含量的影響，以明確高分子雜質(zhì)產(chǎn)生的影響因素，用于指導(dǎo)優(yōu)化制備工藝、選擇適宜的貯藏條件、制定有效的質(zhì)量控制指標(biāo)和限度，以及確定合適的臨床使用方法。

*檢查方法

高分子雜質(zhì)的檢查方法通常應(yīng)參照中國藥典的方法，重點考察系統(tǒng)適用性，并要進(jìn)行方法驗證，這一點對新藥尤為重要。

*對照品的制備

如果某些β-內(nèi)酰胺類抗生素在特定條件下不能完全締合，無法采用“自身”對照外標(biāo)法定量時，可以用結(jié)構(gòu)與研制產(chǎn)品類似，且能夠完全締合的其他藥物制備對照品，進(jìn)行自身對照外標(biāo)法定量，但在計算結(jié)果時應(yīng)考慮二者分子量的差異。例如，硫酸頭孢噻利在特定條件下不能完全締合，可以選擇結(jié)構(gòu)與頭孢噻利類似的頭孢曲松制備對照品進(jìn)行定量；硫酸頭孢匹羅可以采用頭孢他啶制備對照品進(jìn)行定量。

*質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

《中國藥典》2005年版中供注射用頭孢類抗生素原料藥和注射劑大都納入了聚合物檢查項，青霉素類抗生素口服原料藥和制劑也定入了聚合物檢查項。因β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)的含量與生產(chǎn)工藝直接相關(guān)，同一產(chǎn)品采用不同的生產(chǎn)工藝，其聚合物的含量也不同，且高分子雜質(zhì)的含量直接影響過敏反應(yīng)的發(fā)生率，故在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中控制高分子雜質(zhì)的含量是控制產(chǎn)品質(zhì)量、降低過敏反應(yīng)發(fā)生率，保障臨床用藥安全的有效措施。通常注冊申請人應(yīng)考慮將高分子雜質(zhì)檢查納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并制定合理的限度；或作為企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢查項目，高分子雜質(zhì)的限度與其他雜質(zhì)一樣，同樣要有安全性研究結(jié)果的支持。

相關(guān)鏈接：

高分子雜質(zhì)系指藥物中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。分子量一般在1000~5000道爾頓，個別可至10000道爾頓。

β-內(nèi)酰胺類抗生素高分子雜質(zhì)有外源性和內(nèi)源性兩種。外源性一般源于發(fā)酵工藝，為蛋白、多肽、多糖等雜質(zhì)與抗生素結(jié)合的雜質(zhì)。內(nèi)源性系指抗生素藥物自身聚合的產(chǎn)物。聚合物既可來自生產(chǎn)過程，又可在貯藏過程中形成，甚至在用藥時也可以產(chǎn)生。如阿莫西林顆粒在采用開水沖服時，其高分子雜質(zhì)可增加100倍。

β-內(nèi)酰胺類抗生素主要包括青霉素和頭孢菌素兩大類，除青霉素G和V外，臨床中常用的β-內(nèi)酰胺類抗生素均為半合抗生素，故除青霉素G和V中還含有少量青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽外，其他產(chǎn)品中的高分子雜質(zhì)主要是聚合物。

阿莫西林的研究進(jìn)展？

【摘要】藥物阿莫西林的原有劑型有片劑、膠囊劑等，目前又出現(xiàn)了一些新的劑型、制劑，為了適應(yīng)新劑型、制劑的要求和進(jìn)一步完善阿莫西林原有的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，筆者對測定阿莫西林制劑含量的方法進(jìn)行了研究，并在本文中作了闡述。 【關(guān)鍵詞】阿莫西林制劑含量測定方法研究進(jìn)展 作為光譜抗生素藥物的一種，臨床上阿莫西林被廣泛應(yīng)用，其又名為羥氨芐青霉素，屬β-內(nèi)酰胺青霉素類抗生素。作為阿莫西林研究的一個重要方面，阿莫西林制劑的含量的測定方法一直備受關(guān)注。筆者對測定阿莫西林制劑含量的方法進(jìn)行了研究，并在本文中作了闡述，以供參考。 測定阿莫西林制劑含量的方法主要有微生物效價測定法、碘量法、電位滴定法、旋光法、分光光度法以及流動注射化學(xué)發(fā)光法等，下面對以上這幾種方法一一說明。 一微生物效價測定法 作為抗生素測定經(jīng)典方法之一，微生物效價測定法同樣適用于阿莫西林制劑含量的測定，通過該種方法測定出的資料能夠直接反應(yīng)阿莫西林對病菌微生物的抑殺能力，但該種方法的不足之處是實驗操作繁瑣、工作量較大。具體方法是以藤黃八疊球菌***28001***為試驗菌種，試驗培養(yǎng)基為藥典Ⅰ號培養(yǎng)基進(jìn)行實驗，最低檢測濃度為0.05mg/L，日內(nèi)和日間變異系數(shù)小于15%，線性范圍為0.05～400mg/L***r=0.997 7，P<0.01***，符合生物樣品分析要求。 二碘量法 碘量法是利用阿莫西林分子不消耗碘，而其降解產(chǎn)物消耗碘的特性來測定阿莫西林含量的方法，也是一種測定青霉素類抗生素較為通用的方法。具體方法是先將阿莫西林制劑水解成阿莫西林噻唑酸，然后用足夠的、定量的碘與其發(fā)生反應(yīng)，之后再用準(zhǔn)硫代硫酸鈉滴定剩余的碘，從而測出消耗碘的阿莫西林的量，最終測出制劑中阿莫西林的含量。 三電位滴定法 電位滴定法是利用阿莫西林的降解產(chǎn)物能夠與汞鹽***Hg2+***發(fā)生反應(yīng)，形成巰基化物汞鹽這一特性而得以測定制劑中阿莫西林含量的，青霉素類化合物的降價降解產(chǎn)物普遍存在這一特性。該種方法先將阿莫西林制劑水解，然后以鉑電極為指示電極、Hg-Hg2SO4為參比電極，然后用硝酸汞滴定液***0.02 mol/L***滴定，最終測得制劑中阿莫西林的含量。 四旋光法 旋光法測定制劑中阿莫西林含量操作簡單、耗時段，該種方法主要是利用了阿莫西林具有旋光性這一特點，需要注意的是在繪制工作曲線過程中要將檢測溫度嚴(yán)格控制在***20℃±0.5***℃，阿莫西林濃度在0.5～1.5mg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均回收率為99.56%，RSD為1.2%。 五分光光度法 分光光度法主要有比色法、紅外分光光度法、原子吸收分光光度法、熒光分光光度法等方法。 1、比色法測定阿莫西林制劑中阿莫西林含量的比色法是基于其能夠與有機溶劑發(fā)生反應(yīng)形成有色物質(zhì)而進(jìn)行的，該種實驗方法要求反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間以及反應(yīng)***pH***介質(zhì)必須固定，因該種方法影響因素較多且操作步驟復(fù)雜，一般較少采用。 2、紅外分光光度法 紅外分光光度法技術(shù)主要適用于測定阿莫西林膠囊中阿莫西林含量，它是利用漫反射紅外光譜分析技術(shù)對待測樣品進(jìn)行非破壞性、非污染性含量測定。該種方法具有操作簡單且檢測速度快的優(yōu)點，不足之處是誤差相對較大。具體測定方法是以KBr作為稀釋劑，準(zhǔn)確稱量并配制標(biāo)準(zhǔn)樣品系列，然后用18.4倍的KBr對樣品進(jìn)行稀釋，混勻，研細(xì)，用固定的樣品槽均勻裝樣，壓片，測定各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的紅外光譜。選擇輔料淀粉無干擾的1672.18cm-1為分析峰，840.62cm-1為參考峰，之后應(yīng)用軟體進(jìn)行定量分析處理，平均回收率為99.6%。 3、原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法利用高錳酸鉀在堿性介質(zhì)中能夠與阿莫西林含硫化合物的發(fā)生反應(yīng)這一特性，在這個反應(yīng)中高錳酸鉀被還原為錳酸根，并與氯化鋇中的鋇離子結(jié)合成藍(lán)色錳酸鋇沉淀，之后再經(jīng)流動注射線上過濾稀釋，以AAS法測定濾液中反應(yīng)剩余錳的量，從而間接得出被測制劑中阿莫西林的含量。該種方法經(jīng)化學(xué)引數(shù)及流動注射引數(shù)優(yōu)化，同藥典法比起來，資料更為準(zhǔn)確。 4、熒光分光光度法 之所以可以用熒光分光光度法測定制劑中阿莫西林的含量，是因為其具有較好的熒光性質(zhì)，尤其是在激發(fā)波長***λex***277nm與發(fā)射波長***λem***303nm處，阿莫西林的熒光值最大。阿莫西林分子中既含有酸性基團又含有堿性基團，這就使得熒光光譜對于溶液的酸度相當(dāng)敏感。有關(guān)實驗結(jié)果表明，阿莫西林在微堿性溶液中的熒光發(fā)射最強，隨著溫度的升高，其熒光輕度會下降，且與Ca2+、Mg2+等無機離子有配合作用。如果在溶液中加入丙酮，阿莫西林的熒光強度會降低，甚至猝滅；如果向溶液中加入乙醇或甲醇溶液，其熒光強度會增加。除此之外，CTAB（表面活性劑）對其還有增效的作用。因為該種方法的選擇性和靈敏度都相對較高，因此被廣泛用于藥物的前期分析。 六流動注射化學(xué)發(fā)光法 流動注射化學(xué)發(fā)光法的具體操作是先將阿莫西林樣品注入水的載體流，再將其與鹽酸中的二價鈀試劑流混合，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時，阿莫西林會與二價鈀形成黃色的混合物，這種黃色混合物在波長400nm處時吸收最大，其吸收度會隨著濃度的增大而增強。在硫酸溶液中，阿莫西林會生成含巰基的降解產(chǎn)物，在羅丹明6G的增敏作用下，含巰基的化合物（阿莫西林的降解產(chǎn)物）能夠和Ce***Ⅳ***發(fā)生發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)較強的化學(xué)發(fā)光。該中測定阿莫西林含量方法的優(yōu)點是靈敏度較高，且線性范圍寬，能夠有效排除樣品劑型對測定結(jié)果的干擾。 七結(jié)語 從上文中我們可以看出，測定制劑阿莫西林含量的方法有很多，除了以上這六種外，還有高效液相色譜法等其它方法。我們從這些方法中不難看出，分析技術(shù)趨向微量、靈敏、簡便、專屬、快速和自動化是今后測定制劑阿莫西林含量方法的發(fā)展方向。阿莫西林含量的測定能夠有效指導(dǎo)醫(yī)護人員對于該藥的用量及用法，是阿莫西林研究的一個重要方面。希望以上方法能為醫(yī)護人員提供參考。 參 考 文 獻(xiàn) [1]羅興洪，周進(jìn)東，趙耀軍.高效液相色譜法測定阿莫西林顆粒中高分子雜質(zhì)[J].中國藥業(yè)，2004，13***5***:32-3. [2]劉媛，丁嵐，謝孟峽.動物組織中阿莫西林殘留的液相色譜分析方法研究[J].色譜，2007，21***6***:541-544. [3]沈錚，張亮，馮艷.HPLC-MS同時測定人血漿中阿莫西林和克拉維酸的濃度[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2008，33***1***: 24-27.

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