我國(guó)首次利用熒光偏振技術(shù)篩選新藥

日前，記者從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國(guó)家藥物篩選中心了解到，該中心科研人員在我國(guó)首次制備成功兩種熒光偏振技術(shù)專用的熒光標(biāo)記藥物靶點(diǎn)配基，建立了兩種高通量藥物篩選模型。

熒光偏振技術(shù)（又稱熒光極化技術(shù)），是根據(jù)分子運(yùn)動(dòng)頻率和熒光偏振原理建立的熒光分析技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)可以靈敏地分析分子間的相互作用，特別是對(duì)于大分子（如蛋白質(zhì)）與小分子（如化合物）之間的相互作用，可以通過(guò)熒光偏振的角度變化得到特異的反應(yīng)，是一種理想的研究方法。國(guó)外已經(jīng)將此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用在多種藥物的篩選中，而我國(guó)一直沒(méi)有應(yīng)用。

這項(xiàng)研究為國(guó)家科技部支持的“863”計(jì)劃“創(chuàng)新藥物與中藥現(xiàn)代化”重大科技項(xiàng)目中的“藥物篩選平臺(tái)”專項(xiàng)。在該所副所長(zhǎng)杜冠華教授的指導(dǎo)下，張?zhí)焯?、王金華兩位博士后等科研人員反復(fù)實(shí)驗(yàn)，突破了小分子熒光標(biāo)記的關(guān)鍵技術(shù)，制備了兩種熒光偏振技術(shù)專用的熒光標(biāo)記藥物靶點(diǎn)配基；通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的方法，建立了兩種高通量藥物篩選模型，可靈敏地篩選出能夠與靶點(diǎn)相結(jié)合的小分子化合物。

據(jù)介紹，同其他相關(guān)方法比較，該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，假陰性或假陽(yáng)性率低，全部試劑可以在實(shí)驗(yàn)室制備，降低了篩選成本，特別適用于高通量藥物篩選，實(shí)現(xiàn)了每日篩選樣品1萬(wàn)個(gè)的高通量。目前，這兩種模型已經(jīng)完成約16萬(wàn)個(gè)樣品的篩選，發(fā)現(xiàn)了10個(gè)具有研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)前景的活性樣品，為新藥研究提供了重要信息。

據(jù)悉，由該中心建立的這兩種高通量藥物篩選模型均針對(duì)心血管系統(tǒng)的藥物靶點(diǎn)，用于篩選治療心血管疾病的藥物，目前國(guó)內(nèi)、外尚未見(jiàn)同樣模型的報(bào)道。由該模型篩選出的活性樣品（化合物），不僅可以用于新藥研究和開(kāi)發(fā)，而且對(duì)于藥物新靶點(diǎn)的研究也具有重要價(jià)值。

蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)相互作用方法與應(yīng)用的內(nèi)容簡(jiǎn)介

《蛋白質(zhì):蛋白質(zhì)相互作用方法與應(yīng)用》共35章。首先介紹了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和人類遺傳學(xué)/藥物基因組學(xué)等問(wèn)題，并強(qiáng)調(diào)蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然后分三部分介紹了如下內(nèi)容：6個(gè)基于標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)、生物化學(xué)和微生物學(xué)技術(shù)建立起來(lái)的、用于分析蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用的方法；6種鑒定和識(shí)別蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用的生物物理學(xué)方法；近期改進(jìn)過(guò)的與GST沉降和免疫沉淀相關(guān)技術(shù)、兩個(gè)補(bǔ)體系統(tǒng)、漸增截?cái)喾椒?、蛋白成束、高通量方法。最后討論蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)的整合及模型構(gòu)建，以及這些模型在臨床治療方面的應(yīng)用。
《蛋白質(zhì):蛋白質(zhì)相互作用方法與應(yīng)用》內(nèi)容詳盡、具體，為蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用研究的關(guān)鍵技術(shù)提供操作指南，并提供大量識(shí)別和操作蛋白質(zhì)的技術(shù)和相關(guān)綜述，覆蓋了迄今最完全、最有效的分析蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)及原理，從理論的闡述到相關(guān)方案的列舉和比對(duì)，包括經(jīng)典的分子生物學(xué)、生物化學(xué)和微生物學(xué)方法、生物物理學(xué)方法、計(jì)算分析和相互作用模型的構(gòu)建等，系統(tǒng)性好，瀏覽方便，是生命科學(xué)研究者很好的工具書(shū)。 第一部分　概述
第1章　蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
第2章　蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用的定量分析
第二部分　離體實(shí)驗(yàn)方法
第3章　等溫滴定熱分析技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用
第4章　應(yīng)用圓二色光譜分析蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用
第5章　核磁共振譜分析蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用
第6章　應(yīng)用表面等離子共振技術(shù)研究視紫紅質(zhì)一G蛋白相互作用
第7章　使用光散射技術(shù)確定蛋白質(zhì)復(fù)合物的化學(xué)計(jì)量
第8章　沉降平衡研究
第9章　模擬小區(qū)帶凝膠過(guò)濾色譜法檢測(cè)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用
第10章　熒光凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用
第11章　熒光偏振實(shí)驗(yàn)技術(shù)定量研究蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用
第12章　通過(guò)印跡疊加或FarWestern印跡研究蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用
第13章　GST融合技術(shù)研究蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用
第14章　親和毛細(xì)管電泳分析蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用在靶向藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
第15章　羥基蛋白質(zhì)足跡法篩選蛋白質(zhì)一配體相互作用
第16章　利用噬菌體展示和多價(jià)大分子技術(shù)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用抑制劑
第三部分　在異種系統(tǒng)中檢測(cè)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用
第17章　基于轉(zhuǎn)錄激活的細(xì)菌雙雜交系
第18章　應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)相互作用的蛋白
第19章　利用雙誘餌酵母雜交系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用
第20章　用于膜蛋白研究的分裂泛素酵母雙雜交系統(tǒng)
第21章　反向酵母雙雜交技術(shù)
第22章　哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交分析檢測(cè)體內(nèi)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用
第23章　對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀
第四部分　活細(xì)胞中蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用
第24章　熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微技術(shù)
第25章　應(yīng)用流式細(xì)胞分析和熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)活體細(xì)胞內(nèi)分子間相互作用
第26章　熒光相關(guān)譜技術(shù)——定量檢測(cè)分子相互作用的新型技術(shù)
第27章　共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的共定位
第28章　蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)法分析生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)
第29章　細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)交聯(lián)
第五部分　基于蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)
第30章　蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)
第31章　用親和力方法研究磷酸化依賴的相互作用
第32章　蛋FI質(zhì)復(fù)合物的雙向凝膠電泳分析
第33章　凝膠電泳分離的相互作用蛋白質(zhì)用于質(zhì)譜分析前的樣品制備
第34章　應(yīng)用固相同位素標(biāo)記和質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析
第35章　研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)資源專業(yè)詞匯英中對(duì)照 人類基因組測(cè)序的完成標(biāo)志著一個(gè)新的生物學(xué)研究時(shí)代——后基因組時(shí)代(post—genomic era)的來(lái)臨。全基因組的序列信息并不足以解釋及推測(cè)細(xì)胞的各種生命現(xiàn)象，蛋白質(zhì)才是細(xì)胞活性及功能的最終執(zhí)行者，蛋白質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用決定著生物體的復(fù)雜程度，科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)又回到了蛋白質(zhì)上。機(jī)體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間相互交叉作用可以從分子水平揭示蛋白質(zhì)的功能，而且對(duì)于提示生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、凋亡以及理解生物調(diào)控機(jī)制等生命活動(dòng)規(guī)律至關(guān)重要，為探討重大疾病的機(jī)制、疾病治療、疾病預(yù)防和新藥開(kāi)發(fā)提供了重要的理論基礎(chǔ)。因此，了解、闡明蛋白質(zhì)之間相互作用的機(jī)制意義重大，是后基因組時(shí)代生命科學(xué)與其他學(xué)科交叉研究的熱點(diǎn)。

高通量藥物篩選的簡(jiǎn)介

1. 化合物樣品庫(kù)
化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個(gè)來(lái)源。其中,人工合成又可常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。
2.自動(dòng)化的操作系統(tǒng)
自動(dòng)化操作系統(tǒng)利用計(jì)算機(jī)通過(guò)操作軟件控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。操作軟件采用實(shí)物圖像代表實(shí)驗(yàn)用具，簡(jiǎn)潔明了的圖示代表機(jī)器的動(dòng)作。自動(dòng)化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組分，根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設(shè)備以進(jìn)行相應(yīng)的工作。
3.高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)
檢測(cè)系統(tǒng)一般采用液閃計(jì)數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)計(jì)數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。
4.數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)
數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)承擔(dān)4個(gè)方面的功能: 樣品庫(kù)的管理功能;生物活性信息的管理功能; 對(duì)高通量藥物篩選的服務(wù)功能; 藥物設(shè)計(jì)與藥物發(fā)現(xiàn)功能。 常用的篩選模型都在分子水平和細(xì)胞水平，觀察的是藥物與分子靶點(diǎn)的相互作用，能夠直接認(rèn)識(shí)藥物的基本作用機(jī)制。
1.分子水平的藥物篩選模型:受體篩選模型;酶篩選模型;離子通道篩選模型
1.1受體篩選模型:指受體與放射性配體結(jié)合模型。以受體為作用靶的篩選方法,包括檢測(cè)功能反應(yīng)、第二信使生成和標(biāo)記配體與受體相互作用等不同類型。
1.2酶篩選模型:觀察藥物對(duì)酶活性的影響。根據(jù)酶的特點(diǎn),酶的反應(yīng)底物,產(chǎn)物都可以作為檢測(cè)指標(biāo),并由此確定反應(yīng)速度。典型的酶篩選包括1) 適當(dāng)緩沖液中孵化;(2)控制反應(yīng)速度,如:溫度,緩沖液的pH值和酶的濃度等;(3)單時(shí)間點(diǎn)數(shù)器, 需測(cè)量產(chǎn)物的增加和底物的減少。
1.3離子通道篩選模型: (1)貝類動(dòng)物毒素的高通量篩選,其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)，用放射性配體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)考察受試樣品。(2)用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。
2.細(xì)胞水平藥物篩選模型
觀察被篩樣品對(duì)細(xì)胞的作用,但不能反映藥物作用的具體途徑和靶標(biāo),僅反映藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程的綜合作用。包括: 內(nèi)皮細(xì)胞激活; 細(xì)胞凋亡; 抗腫瘤活性; 轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測(cè); 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路; 細(xì)菌蛋白分泌; 細(xì)菌生長(zhǎng)。
高通量篩選技術(shù)與傳統(tǒng)的藥物篩選方法相比有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):反應(yīng)體積?。蛔詣?dòng)化；靈敏快速檢測(cè)；高度特異性。但是，高通量篩選作為藥物篩選的方法,并不是一種萬(wàn)能的手段，首先，高通量篩選所采用的主要是分子、細(xì)胞水平的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，任何模型都不可能充分反映藥物的全面藥理作用；其次，用于高通量篩選的模型是有限的和不斷發(fā)展的，要建立反映機(jī)體全部生理機(jī)能的理想模型，也是不現(xiàn)實(shí)的。但我們應(yīng)該相信，隨著對(duì)高通量篩選研究的深入，隨著對(duì)篩選模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、新的藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)以及篩選模型的新穎性和實(shí)用性的統(tǒng)一，高通量篩選技術(shù)必將在未來(lái)的藥物研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。 光學(xué)測(cè)定技術(shù)。美、英兩國(guó)研究人員在高通量篩選檢測(cè)中，努力進(jìn)行了光學(xué)測(cè)定方法的研究，建立了大量的非同位素標(biāo)記測(cè)定法，如用分光光度檢測(cè)法篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑、組織纖溶酶原激活劑等，均獲得成功。
放射性檢測(cè)技術(shù)。美國(guó)學(xué)者GanieSM在高通量藥物篩選研究中，應(yīng)用放射性測(cè)定法，特別是親和閃爍（SPA）檢測(cè)方法，使在96孔板上進(jìn)行的樣本量實(shí)驗(yàn)得到發(fā)展。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，促進(jìn)了高通量藥物篩選的實(shí)現(xiàn)，但存在環(huán)境污染問(wèn)題。
熒光檢測(cè)技術(shù)。美國(guó)學(xué)者GiulianokA研究認(rèn)為，采用FLIPR（fluor ometricimaging readet）熒光檢測(cè)法，可在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)測(cè)定熒光的強(qiáng)度和變化，對(duì)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子流及測(cè)定細(xì)胞內(nèi)pH和細(xì)胞內(nèi)鈉離子流等，是非常理想的一種高效檢測(cè)方法。
多功能微板檢測(cè)系統(tǒng)。由西安交通大學(xué)藥學(xué)院研制的1536孔板高通量多功能微板檢測(cè)系統(tǒng)，是國(guó)際上先進(jìn)的高通量檢測(cè)系統(tǒng)，它可使篩選量進(jìn)一步提高，現(xiàn)已在該院投入使用。
1．基本原理
高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系，它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。它的正常開(kāi)展需要有一個(gè)高容量的化合物庫(kù)、自動(dòng)化的操作系統(tǒng)、高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)、高效率的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及高特異性的藥物篩選模型。
1.1 化合物樣品庫(kù)
高通量篩選是一種利用已有的化合物進(jìn)行的體外隨機(jī)篩選。因此通過(guò)高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物(leading compounds)的有效性取決于化合物樣品庫(kù)中化合物的數(shù)量及其質(zhì)量?；衔飿悠返臄?shù)量是指不同樣品的數(shù)量?；衔飿悠返馁|(zhì)量主要由化合物結(jié)構(gòu)的多樣性決定的。許多活性反應(yīng)基團(tuán)(reactive groups)使初篩的假陽(yáng)性大量增加，剔除這些化合物可以提高化合物樣品庫(kù)的質(zhì)量。
化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個(gè)來(lái)源。
人工合成又可分為常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。采用常規(guī)化學(xué)合成的純化合物一直是國(guó)外制藥企業(yè)建立化合物樣品庫(kù)的主要來(lái)源。它們通過(guò)長(zhǎng)年積累的化合物建立化合物樣品庫(kù)，通過(guò)購(gòu)買和化合物交流使化合物樣品庫(kù)的數(shù)量和質(zhì)量大幅度提高。
組合化學(xué)(combinatorial chemistry)的出現(xiàn)為大量增加化合物的數(shù)量提供另外一種來(lái)源。組合化學(xué)的基本原理是采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法，在特定的分子母核上加入不同的基團(tuán)，在同樣條件下，產(chǎn)生大量的新化合物。這種方法在化合物的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化方面已經(jīng)表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。但是，由于該方法是基于母核結(jié)構(gòu)的改造，因此產(chǎn)生的大量化合物在結(jié)構(gòu)多樣性方面尚有極大的不足。解決組合化學(xué)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性的問(wèn)題，已經(jīng)成為化學(xué)研究人員的研究課題。
從天然產(chǎn)物中分離出來(lái)的化合物，母核結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)是長(zhǎng)期的自然選擇形成的，它們通過(guò)高通量篩選所表現(xiàn)出來(lái)的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢(shì)。因此，增加樣品庫(kù)中具結(jié)構(gòu)多樣性的天然化合物及其衍生物是提高樣品庫(kù)質(zhì)量的一個(gè)重要途徑?？鐕?guó)制藥企業(yè)為了增加高通量篩選的陽(yáng)性率，已經(jīng)或正在尋求助買我國(guó)的天然產(chǎn)物單體。
1.2 自動(dòng)操作系統(tǒng)
高通量藥物篩選每天要對(duì)數(shù)千化臺(tái)物樣品進(jìn)行檢測(cè)，工作枯燥、步驟單一，人工操作容易疲勞、出錯(cuò)。自動(dòng)化操作系統(tǒng)采用微孔板作為反應(yīng)容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通過(guò)條形碼加以標(biāo)記。自動(dòng)化操作系統(tǒng)通過(guò)光電閱讀器對(duì)特定的微孔板上的特定位置進(jìn)行操作，并將操作結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)存貯在計(jì)算機(jī)內(nèi)，使篩選結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)過(guò)程快速。
自動(dòng)化操作系統(tǒng)編程過(guò)程簡(jiǎn)潔明了，可操作性強(qiáng)。自動(dòng)化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組成都分，根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設(shè)備以進(jìn)行相應(yīng)的工作。
除了實(shí)驗(yàn)步驟的需要以外，自動(dòng)化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。主要有單孔、8孔、96孔、384孔等幾種方式。單孔一般用于對(duì)照樣品以及復(fù)篩中零散樣品的轉(zhuǎn)移。96孔、384孔在酶活性檢測(cè)以及需同時(shí)開(kāi)始、同時(shí)終止反應(yīng)的篩選模型中是必需的。
自動(dòng)化操作系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過(guò)程中用來(lái)放置樣品板、反應(yīng)板以及對(duì)它們進(jìn)行轉(zhuǎn)移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數(shù)量取決于堆棧的容量。
由此可見(jiàn)，高通量藥物篩選的自動(dòng)化操作系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)及其操作軟件、自動(dòng)化加樣設(shè)備、溫孵離心等設(shè)備、堆棧4個(gè)部分組成。不同的單位可根據(jù)主要篩選模型類型、篩選規(guī)模選購(gòu)不同的部分整合成為一個(gè)完整的操作系統(tǒng)。
1.3 檢測(cè)系統(tǒng)
快速、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)是高通量藥物篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。檢測(cè)儀器靈敏度的不斷提高，即使對(duì)微量樣品的檢測(cè)，也可以得到很好的檢測(cè)效果。
1.3.1 液閃計(jì)數(shù) 放射性同位素廣泛用于受體結(jié)合測(cè)定、細(xì)胞毒性、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、藥物代謝示蹤以及基因分析中。由于采用了雙光電倍增管及時(shí)間分辨偶合回路(time-resolved coincidence circuit)技術(shù)，有效地降低了背景信號(hào)的干擾，使測(cè)定靈敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析檢測(cè)中，背景信號(hào)可控制在10cpm左右。
親和閃爍分析(scintil1ation proximity assay，SPA)是一種新的液閃分析法。該方法在細(xì)胞表面受體藥物篩選中應(yīng)用較為普遍。在高通量篩選測(cè)定細(xì)胞表面受體親合結(jié)合作用時(shí)，放射配體標(biāo)記濾過(guò)分析技術(shù)由于需要進(jìn)行分離，現(xiàn)已被親合閃爍分析所取代。親合閃爍分析技術(shù)通過(guò)親合結(jié)合，將放射性配基結(jié)合到具有受體的閃爍球上，從而產(chǎn)生光子，減少了放射配體標(biāo)記分析中的游離配基與結(jié)合配基的分離過(guò)程，使得放射配基分析可完全以自動(dòng)化的方式進(jìn)行，適于進(jìn)行高通量篩選。產(chǎn)生低能量放射粒子的同位素可被用來(lái)進(jìn)行放射性標(biāo)記，而這種低能量放射粒子在短距離內(nèi)可被重吸收，以確保只有結(jié)合到受體表面的配基才被檢測(cè)到。SPA技術(shù)被廣泛的應(yīng)用到激酶、核酸處理酶分析以及受體配體的相互作用分析中。
1.3.2 分光光度法 為了適應(yīng)高通量藥物篩選，許多公司都生產(chǎn)了具備計(jì)算機(jī)接口并能對(duì)多孔板進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的分光光度計(jì)。以Molecular Device公司的spectra 190為例，它采用8條光導(dǎo)纖維同時(shí)對(duì)8孔進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定波長(zhǎng)以2nm為間隔，可以在190nm一850nm間進(jìn)行選擇。對(duì)未知物質(zhì)，可在該范圍內(nèi)進(jìn)行掃描以確定其特征吸收光譜。因此，大大增加了建立模型的多樣性。檢測(cè)數(shù)據(jù)以不同文件格式輸出，可用隨機(jī)軟件或通用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理。方便、快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高。分光光度法高靈敏儀器同自動(dòng)化操作系統(tǒng)的連接，使得基于紫外、可見(jiàn)光譜的高通量藥物篩選模型成為主要模型種類。
1.3.3 化學(xué)發(fā)光檢測(cè) 化學(xué)發(fā)光指生色物質(zhì)在酶促作用下，化學(xué)能以光子的形式釋放出來(lái)?；瘜W(xué)發(fā)光根據(jù)發(fā)光的形式和種類分為輝光型和閃光型發(fā)光兩種。輝光型化學(xué)發(fā)光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等為基礎(chǔ)的發(fā)光反應(yīng)。其發(fā)光時(shí)間較長(zhǎng)且穩(wěn)定。而以發(fā)光蛋白、ATP、熒光素酶等為底物的發(fā)光反應(yīng)則是閃光型發(fā)光反應(yīng)，其發(fā)光時(shí)間較短。由于時(shí)間分辨及偶合回路技術(shù)的使用，對(duì)于背景的去除更為有效，使得化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1pg數(shù)量級(jí)。在單孔多點(diǎn)噴射技術(shù)中，用于檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的光導(dǎo)纖維末端帶有一噴頭，用來(lái)加入反應(yīng)性底物。反應(yīng)性底物從100個(gè)小孔噴出，使反應(yīng)性底物加入孔中后即可均勻混合。發(fā)光反應(yīng)同時(shí)啟動(dòng)后，可立即進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于閃光性化學(xué)發(fā)光的測(cè)定更為有利。
1.3.4 激發(fā)熒光檢測(cè) 新型激發(fā)熒光檢測(cè)儀在傳統(tǒng)儀器的基礎(chǔ)上，用連續(xù)的激發(fā)光諧和測(cè)定光譜取代固定光譜，使模型的建立更具備靈活性。熒光檢測(cè)方法靈敏是因?yàn)槎鄶?shù)熒光基團(tuán)都有短暫的半衰期，即使用較弱的激發(fā)光源也能獲得大量的光子流。這種特性以及多種可采用的熒光模式，使得熒光檢測(cè)技術(shù)成為高通量篩選必不可少的應(yīng)用手段。熒光技術(shù)在均相篩選分析中廣為應(yīng)用。其中，包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，熒光偏振(FP)，時(shí)間分辨熒光(TRET)以及熒光相關(guān)譜(FCS)等技術(shù)。
1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)
高通量藥物篩選的特點(diǎn)是對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的化合物樣品進(jìn)行多模型的篩選。與高通量藥物篩選相適應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)主要承擔(dān)4個(gè)方面的功能。
樣品庫(kù)的管理功能：化合物樣品庫(kù)對(duì)進(jìn)行高通量藥物篩選的化合物樣品的各種理化性質(zhì)進(jìn)行存儲(chǔ)管理。對(duì)每一個(gè)新入庫(kù)的化合物進(jìn)行新穎性分析，排除結(jié)構(gòu)雷同的化合物，避免不必要的篩選。由于高度反應(yīng)性基團(tuán)增加了假陽(yáng)性出現(xiàn)的機(jī)率，樣品庫(kù)對(duì)新入庫(kù)的化合物進(jìn)行反應(yīng)基因檢測(cè)以去除這類化合物。
生物活性信息的管理功能：生物活性庫(kù)存貯每一化合物經(jīng)過(guò)不同模型檢測(cè)后的結(jié)果，并根據(jù)多個(gè)模型的檢測(cè)結(jié)果對(duì)化合物的生物活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。
對(duì)高通量藥物篩選的服務(wù)功能：高通量藥物篩選的工作量大，自動(dòng)化程度高，也涉及到許多繁瑣的工作。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)對(duì)與藥物篩選相關(guān)的業(yè)務(wù)往來(lái)通訊、檔案管理以及各種樣品標(biāo)簽的打印進(jìn)行管理，使高通量藥物篩選的各個(gè)環(huán)節(jié)程序化、標(biāo)準(zhǔn)化。
藥物設(shè)計(jì)與藥物發(fā)現(xiàn)功能：高通量藥物篩選產(chǎn)生大量的化合物結(jié)構(gòu)信息，隨著篩選的進(jìn)行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)通過(guò)對(duì)同一模型不同的呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，找出其構(gòu)效關(guān)系，從而為藥物設(shè)計(jì)提供參考。
1.5 篩選模型
是指用于檢測(cè)藥物作用的實(shí)驗(yàn)方法。由于高通量篩選要求反應(yīng)總體積小，而且，反應(yīng)具有較高特異性和敏感性，因此對(duì)于篩選模型也要求較高。這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細(xì)胞反應(yīng)方面?；蛩降乃幬锖Y選模型，使藥物篩選模型的范圍更為廣泛。
1.5.1 以酶為靶的高通量篩選 以酶為作用靶的高通量篩選方法，絕大多數(shù)是直接檢測(cè)酶活性。具體方法根據(jù)酶的不同而不同，主要有基于放射性的方法和基于比色、熒光的方法兩大類。
基于放射性的方法多是將底物標(biāo)記，測(cè)定放射性產(chǎn)物的生成。Taft等建立了(1,3)β-葡聚糖合酶抑制劑(抗真菌)的高通量篩選方法。將含有酶的菌絲提取物、α-淀粉酶和UDP-14C-葡萄糖加入96孔板的孔中，溫孵、反應(yīng)。終止反應(yīng)后，濾去未被合成進(jìn)入的底物。閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)濾器上保留的(1,3)β-葡聚糖，指示酶活性大小。
也有將酶標(biāo)記，測(cè)定被特異結(jié)合的酶的方法。Vollmer等建立了一種以青霉素結(jié)合蛋白(PBP)為靶的抗生素的高通量篩選方法。PBP既是糖基轉(zhuǎn)移酶又是肽轉(zhuǎn)移酶，該法是篩選其糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)上的可結(jié)合物。將莫諾霉素(moenomycin)結(jié)合于一種小球上，制成混懸液，加入96孔板，然后加入3H標(biāo)記的PBP(細(xì)菌膜粗提物)和受試化合物，孵育、過(guò)濾去掉非結(jié)合的放射性，閃爍計(jì)數(shù)測(cè)得的放射性指示PBP與莫諾霉素結(jié)合的情況及受試化合物對(duì)其影響。
另外，基于放射性而無(wú)需過(guò)濾分離的SPA也有應(yīng)用。Brown等建立了內(nèi)源性肽酶的水解活性檢測(cè)方法，用以研究其抑制劑。用3H標(biāo)記的肽底物，通過(guò)生物素(biotin)與抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA閃爍球相連。酶解使3H隨肽的斷裂而離開(kāi)閃爍球。測(cè)定3H放射性作用于閃爍球產(chǎn)生的閃爍信號(hào)的丟失量，即指示酶活性大小。
基于比色、熒光等的方法有一些報(bào)道。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制劑的篩選方法。酸性條件下，脂的過(guò)氧化物能把Fe2+氧化為Fe3+，然后氧化二甲酚橙(xylenol orange)，產(chǎn)物在可見(jiàn)光區(qū)620nm有強(qiáng)烈吸收。在96孔板上測(cè)定。Zhang等建立了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(抗病毒藥物)的高通量篩選方法。方法使用了“同質(zhì)時(shí)間分辨熒光”(homogenous time resolved fluorence，HTRF)技術(shù)，既實(shí)現(xiàn)了非分離操作(同質(zhì))，又避免了放射性同位素的使用。該方法基于逆轉(zhuǎn)錄酶能很容易地將核苷酸類似物(如生物素-11-dUTP)引入新生DNA鏈。在96或384孔板上，將生物素化的引物/模板與抗生蛋白鏈菌素-銪在板孔中混合孵育，加入逆轉(zhuǎn)錄酶，再加入生物素-dUTP和d-TTP混合物啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)60min后，加入鏈親和素-別藻藍(lán)蛋白(streptavidin-allophycocyanin)，孵育，用HTRF分析儀讀取數(shù)據(jù)。該法也可用于多種其他的核酸聚合酶。
1.5.2 以受體為靶的高通量篩選 以受體為作用靶的高通量篩選方法。檢測(cè)功能反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是易于區(qū)分激動(dòng)劑和拮抗劑。經(jīng)典的功能檢測(cè)方法通量低，而引入基于重組技術(shù)的報(bào)告基因檢測(cè)方法極大地提高了篩選通量，既高效且節(jié)省成本。檢測(cè)第二信使或下游機(jī)制如磷酸化，傳統(tǒng)方法也比較麻煩，不適于高通量檢測(cè)，但將這些機(jī)制與報(bào)告基因相偶聯(lián)則能克服。
1.5.3 以離子通道為靶的高通量篩選 Negri等建立了貝類動(dòng)物毒素的高通量篩選方法。其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)結(jié)合位點(diǎn)，用放射性配體(3H-STX)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)考察受試樣品。Yong等用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。
1.5.4 以核酸為靶的高通量篩選 Hamasaki等建立了以16S rRNA編碼區(qū)結(jié)構(gòu)和HIV-RRE RNA結(jié)構(gòu)為靶的抑制劑的高通量篩選方法。尋找類似氨基糖甙類抗生素而親和力更高或作用于相同核酸的其他位點(diǎn)的新化合物，以及不易被代謝失活的新化合物。方法基于當(dāng)含芘的氨基甙類似物結(jié)合于RNA時(shí)，芘的熒光被淬滅的原理。在96孔板上，將芘碳酰巴龍霉素(PCP)，RNA結(jié)構(gòu)配成溶液后加入有受試化合物的板孔中，用熒光讀板器考察熒光恢復(fù)的程度。
1.5.5 以細(xì)胞功能為基礎(chǔ)的高通量篩選
1.5.5.1 內(nèi)皮細(xì)胞激活 內(nèi)皮細(xì)胞激活是急慢性炎癥過(guò)程中重要的組成環(huán)節(jié)。Rice等以E選擇蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)作為標(biāo)志，建立了內(nèi)皮細(xì)胞激活抑制劑的高通量篩選方法。建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。IL-1刺激下，E選擇蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)用ELISA方法定量。方法包括細(xì)胞固定、加液、加受試化合物等操作，能保持細(xì)胞完整，不昂貴，可重復(fù)，篩選速度可達(dá)每星期1000種化合物。適用化合物范圍很寬，并且方法用細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象，使能夠較早地發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)化合物的攝取及化合物的細(xì)胞毒性。
1.5.5.2 細(xì)胞凋亡 Erusalimsky等建立了新型細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)物的高通量篩選方法。細(xì)胞預(yù)先用3H 胸苷標(biāo)記，與凋亡誘導(dǎo)物孵育后，連續(xù)經(jīng)過(guò)兩種玻璃濾器。一個(gè)是中性的，捕獲完整的染色質(zhì)和高分子量DNA。另一個(gè)裝有DEAE活性基團(tuán)，捕獲低分子量DNA碎片。通過(guò)對(duì)濾器上放射性的測(cè)量，可以對(duì)DNA的破碎情況定量。
1.5.5.3 抗腫瘤活性 Lu等建立了用高通量“生物活性指紋”篩選抗肺癌藥物的方法，考察受試分子(類維生素A及類維生素A相關(guān)分子)對(duì)許多不同細(xì)胞系的效應(yīng)特點(diǎn)。檢測(cè)指標(biāo)包括：(1)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)。選擇了約50種腫瘤和非腫瘤細(xì)胞，包括了大量不同的組織和(或)腫瘤來(lái)源。細(xì)胞暴露于受試化合物5d后，用標(biāo)準(zhǔn)比色法測(cè)定存活細(xì)胞百分率。20%生長(zhǎng)抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制檢測(cè)，用以區(qū)分細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用和細(xì)胞殺傷作用。6孔板上加NCI-H292非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，暴露于受試物一定時(shí)間。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，植于無(wú)受試物的培養(yǎng)介質(zhì)共7d。用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞染色，考察集落形成情況。(3)凋亡檢測(cè)，用ELISA方法測(cè)量細(xì)胞DNA破碎。(4)轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測(cè)，用以考察受試化合物是否有類維生素A受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制作用。方法是將HeLa TK-細(xì)胞用73Col-CAT報(bào)告基因連同受體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，與受試物一起培養(yǎng)，用ELISA方法檢測(cè)CAT活性。
1.5.5.4 G2檢查點(diǎn)(G2 checkpoint) Roberge等建立了G2期檢查點(diǎn)抑制劑的高通量篩選方法。將MCF-7m p53細(xì)胞培養(yǎng)，種在96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板上。照射使細(xì)胞進(jìn)入G2靜止期，加入受試化合物用ELISA方法檢測(cè)核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，從而得到從G2期釋放進(jìn)入M期的細(xì)胞數(shù)量，即抑制G2檢查點(diǎn)程度。
1.5.5.5 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量篩選方法。構(gòu)建融合報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，選擇蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)能被TGFβ高誘導(dǎo)的克隆。將細(xì)胞植于96孔板，與受試化合物孵育后，稀釋并加入Steady-Glo底物測(cè)蟲(chóng)熒光素酶活力，與對(duì)照比較，計(jì)算相對(duì)酶活性增加值。
1.5.5.6 細(xì)菌蛋白分泌 Alksne等建立了以抑制細(xì)菌蛋白分泌為作用方式的新型抗生素的高通量篩選方法。該方法基于SecA-lacZ融合報(bào)告基因。SecA是一種自我調(diào)控翻譯的蛋白，當(dāng)細(xì)菌蛋白分泌被干擾時(shí)，該報(bào)告基因被誘導(dǎo)。
1.5.5.7 細(xì)菌生長(zhǎng) Chung等建立了抑制分枝桿菌生長(zhǎng)化合物的高通量篩選方法。選擇了一種腐生性分枝桿菌代替結(jié)核分枝桿菌，因其具有生長(zhǎng)迅速以及非感染性的特點(diǎn)。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞攝入放射性標(biāo)記的尿嘧啶，考察受試化合物對(duì)分枝桿菌活力的作用。用96孔板的形式，1d內(nèi)可以測(cè)試數(shù)千個(gè)樣品。
2．生藥活性成分的高通量篩選
樣品是高通量藥物篩選的物質(zhì)基礎(chǔ)，樣品庫(kù)來(lái)源的化學(xué)多樣性是決定高通量篩選技術(shù)能否成功的關(guān)鍵因素之一。前面我們談到，化合物樣品主要有常規(guī)化學(xué)合成、組合化學(xué)合成和從天然產(chǎn)物中分離純化幾個(gè)來(lái)源。而從天然產(chǎn)物中分離出來(lái)的化合物，由于其母核結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)是長(zhǎng)期的自然選擇形成的，它們具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢(shì)。
我國(guó)擁有非常豐富的藥材資源，幾十年來(lái)，我們應(yīng)用藥理學(xué)手段，對(duì)我國(guó)的傳統(tǒng)藥物進(jìn)行了大規(guī)模的研究和篩選，取得了巨大成就。但是，僅僅依靠傳統(tǒng)的藥理實(shí)驗(yàn)方法，既耗時(shí)，勞動(dòng)強(qiáng)度又大，還需要使用大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，顯然不能適應(yīng)大量樣品的同時(shí)篩選。雖然經(jīng)過(guò)努力，已從生藥中分離、提取、純化出大量化合物，但由于研究手段的落后，使大量分離出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物資源的極大浪費(fèi)。
因此，將高通量篩選技術(shù)應(yīng)用于生藥的活性成分研究，既是對(duì)高通量篩選技術(shù)的不斷完善，又是將這一技術(shù)應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化研究的有益嘗試。
如何對(duì)生藥的活性成分進(jìn)行高通量篩選呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量篩選基本一致，區(qū)別主要在于篩選前需要從生藥中將化合物提取出來(lái)并進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x和化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)。相同的就不再贅述，這里主要談一下提取、分離和多樣性評(píng)價(jià)的問(wèn)題。
2.1 提取 由于高通量篩選需要大量的樣品來(lái)源，所以常規(guī)的提取方法顯然不能滿足這一要求。尋找一個(gè)快速、高效、連續(xù)、自動(dòng)化的提取方法顯得迫在眉睫。加速溶劑提取技術(shù)是一個(gè)新的提取技術(shù)，在準(zhǔn)備好樣品和對(duì)提取方法（或程序）進(jìn)行設(shè)定后，自動(dòng)進(jìn)樣和自動(dòng)收集裝置就可以連續(xù)對(duì)最多24個(gè)不同樣品自動(dòng)完成樣品的提取和提取液的收集，簡(jiǎn)單方便。應(yīng)用這一技術(shù)，可以得到大量的生藥的提取物。
2.2 分離及化學(xué)多樣性評(píng)價(jià) 我們都知道，生藥的化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜，通過(guò)提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物，所以篩選前需要對(duì)生藥的提取物進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x。在眾多的分離手段中，制備型HPLC應(yīng)該是最為理想的，它具有快速、高效、自動(dòng)化等諸多優(yōu)點(diǎn)。
分離完成后還需要對(duì)分離的物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)，以提高高通量篩選的效率。以前，這種評(píng)價(jià)多是基于物種的地理分布、生物學(xué)分類、化學(xué)分類以及基源等關(guān)系，隨著科技的進(jìn)步，多種現(xiàn)代化手段開(kāi)始應(yīng)用于化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)。其中，色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ESI-MS）技術(shù)在這方面做出了有力的嘗試。首先，它做出成分的離子信號(hào)（m/z）對(duì)保留時(shí)間的平面圖，然后對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的相似度評(píng)估從而對(duì)樣品的多樣性進(jìn)行定量的評(píng)價(jià)。接著，三維的HPLC數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為CDF文件格式并傳輸?shù)経NIX工作站。數(shù)據(jù)文件中的每一個(gè)離子（包括保留時(shí)間、質(zhì)量、離子強(qiáng)度等數(shù)據(jù)）被定位在一個(gè)二維圖譜中，保留時(shí)間和質(zhì)量分占一個(gè)軸，離子強(qiáng)度數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在位點(diǎn)中。濾除噪聲以后，離子的中心時(shí)間和中心質(zhì)量被計(jì)算出來(lái)。根據(jù)對(duì)LCMS的數(shù)據(jù)處理，混合物間的相似度被定量地計(jì)算出來(lái)。這種數(shù)據(jù)處理基于以下的一種關(guān)系，這種關(guān)系表征了樣品1中的離子i和樣品2中的離子j的“化學(xué)空間”距離。
其中，ti表示離子i的色譜保留時(shí)間，mi表示離子i的質(zhì)荷比（m/z），wt是保留時(shí)間的權(quán)重系數(shù)，wm是質(zhì)量的權(quán)重系數(shù)。dij是離子i和離子j的歐幾里的距離，n1和n2分別是樣品1和樣品2中確認(rèn)的離子數(shù)。sij是離子i和離子j之間的相似度（0-1），相似度值為1表明是相同樣品，相反，相似度值接近0則表明樣品具有很高的化學(xué)多樣性。通過(guò)這種方法，可以很好的解決樣品化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)問(wèn)題。

熒光偏振法快速準(zhǔn)確高通量檢測(cè)IgG和含F(xiàn)c段衍生物

熒光偏振法快速、準(zhǔn)確、高通量檢測(cè)IgG和含F(xiàn)c段衍生物

Dr. Carolanne Doherty

Valitacell, NIBRT, Fosters Avenue, Blackrock, Dublin, Ireland

? ? BMG多功能酶標(biāo)儀可應(yīng)用于定量IgG的新技術(shù)Valita?TITER

采用熒光偏振法直接在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)IgG

酶標(biāo)儀預(yù)設(shè)檢測(cè)程序和數(shù)據(jù)分析模板提高研究速度

簡(jiǎn)介

準(zhǔn)確、快速和高通量檢測(cè)IgG對(duì)于大多數(shù)治療性抗體的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)來(lái)說(shuō)是必不可少的。單克隆抗體正在生物藥物領(lǐng)域大顯身手，大量的樣本正等待著進(jìn)行篩選以進(jìn)一步得到開(kāi)發(fā)。這里我們介紹一種在細(xì)胞培養(yǎng)上清中直接定量IgG的全新的篩選技術(shù)：Valita?TITER。

現(xiàn)有的技術(shù)，包括蛋白A高效液相色譜（HPLC protein A）、ELISA技術(shù)、 蛋白A表面干涉法以及HTRF（均相時(shí)間分辨熒光）都具有明顯的缺點(diǎn)，包括價(jià)格昂貴、耗力以及耗時(shí)。

Valita?TITER方法是一種全新的非常精確、低成本的檢測(cè)IgG的方案，檢測(cè)范圍在2.5-80mg/L。Valita?TITER采用熒光偏振技術(shù)檢測(cè)IgG的Fc段與蛋白G的結(jié)合（圖1）。分析在96孔板中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單、高通量、快速且可自動(dòng)化完成。分析可以在很少量的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行且沒(méi)有繁瑣的準(zhǔn)備過(guò)程。

在這個(gè)應(yīng)用指引中，我們介紹了在PHERAstar?，POLARstar? Omega以及CLARIOstar?多功能酶標(biāo)儀上使用Valita?TITER試劑盒定量檢測(cè)IgG的方案。

熒光偏振可以有效地分析分子大小的改變?！安粍?dòng)”的熒光基團(tuán)在偏振光的激發(fā)下會(huì)發(fā)出與激發(fā)光相同偏振方向的熒光。然而，轉(zhuǎn)動(dòng)的熒光基團(tuán)的熒光偏振方向與激發(fā)光偏振方向相比會(huì)有一定的改變。在溶液中小分子比大分子轉(zhuǎn)動(dòng)更快，因此，連接有熒光基團(tuán)的分子大小的改變，可以通過(guò)熒光去偏振程度的大小來(lái)進(jìn)行測(cè)定。所以，當(dāng)標(biāo)記有熒光的蛋白G在沒(méi)有結(jié)合其它分子時(shí)，其轉(zhuǎn)動(dòng)快，去偏振更多，而結(jié)合了IgG則相反（大5倍）（圖2）。這種偏振的改變應(yīng)用于檢測(cè)溶液中的IgG。熒光偏振（FP）通過(guò)用平行偏振方向的激發(fā)光照射溶液并在平行方向和垂直方向上測(cè)定發(fā)射熒光。FP就是這兩個(gè)偏振熒光的歸一化后的差別，通常用mP表示。

材料和方法

Valita?TITER分析試劑盒

Valita?TITER APP軟件（試劑盒里提供）

IgG標(biāo)準(zhǔn)品（從人血清中獲得IgG）

PHERAstar, POLARstar Omega和CLARIOstar多功能酶標(biāo)儀 (BMG LABTECH)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

樣品的準(zhǔn)備遵照試劑盒說(shuō)明書(shū)的相應(yīng)要求。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用每個(gè)相對(duì)熒光值對(duì)應(yīng)一個(gè)IgG標(biāo)準(zhǔn)品的方法。在Valta?TITER微孔板的每個(gè)孔中加入60?l重建緩沖液以及60?l標(biāo)準(zhǔn)品或樣品?；靹蚝蟊芄夥跤?0分鐘。然后在POLARstar Omega、PHERAstar或CLARIOstar多功能酶標(biāo)儀（BMG LABTECH公司）中，采用預(yù)置的檢測(cè)程序進(jìn)行讀數(shù)（參數(shù)的設(shè)定詳見(jiàn)下表）。在MARS分析軟件中將獲得的Raw Data轉(zhuǎn)化成.csv格式文件，再用Valita?APP軟件進(jìn)行分析。

儀器設(shè)定

結(jié)果與討論

圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線（2.5-80mg/L）是在BMG LABTECH公司具有熒光偏振檢測(cè)功能的多功能酶標(biāo)儀（POLARstar Omega、CLARIOstar和PHERAstar）上用Valita?TITER試劑盒繪制的。所有酶標(biāo)儀所獲得的結(jié)果都具備很高的穩(wěn)定性。

最后，我們用不同條件培養(yǎng)的樣品，用Valita?TITER定量IgG的結(jié)果與用常規(guī)方法HPLC的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。圖4顯示兩種方法測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性，顯示兩種定量方法都有很好的準(zhǔn)確性，而Valita?TITER分析速度更快因其不需要繁瑣的樣本準(zhǔn)備過(guò)程。

結(jié)論

在研發(fā)和生產(chǎn)此類生物藥物中對(duì)混合樣本進(jìn)行快速IgG濃度測(cè)定非常重要。這里我們介紹了一種基于熒光偏振法的快速、簡(jiǎn)單的進(jìn)行高通量IgG和Fc段衍生物測(cè)定全新技術(shù)——Valita?TITER分析法。Valita?TITER分析法可以直接對(duì)待測(cè)樣本中的IgG進(jìn)行定量測(cè)定而無(wú)需繁瑣的樣本準(zhǔn)備或純化過(guò)程。CLARIOstar， PHERAstar和POLARstar Omega應(yīng)用于Valita?TITER分析時(shí)現(xiàn)實(shí)出卓越的性能。與其它IgG的定量方便相比，Valita?TITER具有高通量、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)。

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