作者:劉炎
關(guān)鍵詞:基因芯片;核酸探針序列;雜交
1 基因芯片概述
隨著人類基因組計(jì)劃(Human Genome Project)即全部核苷酸測序的即將完成
基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法(southern
基因芯片的設(shè)計(jì)實(shí)際上是指芯片上核酸探針序列的選擇以及排布
基因單堿基多態(tài)檢測的芯片一般采用等長移位設(shè)計(jì)法[5]
,即按靶序列從頭到尾依次取一定長度的互補(bǔ)的核苷酸序列形成一探針組合,這組探針是與靶序列完全匹配的野生型探針,然后對于每一野生型探針,將其中間位置的某一堿基分別用其它三種堿基替換,形成三種不同的單堿基變化的核苷酸探針,這種設(shè)計(jì)可以對某一段核酸序列所有可能的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行掃描。芯片制備方法主要包括兩種類型:
(1)點(diǎn)樣法:首先是探針庫的制備,根據(jù)基因芯片的分析目標(biāo)從相關(guān)的基因數(shù)據(jù)庫中選取特異的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增或直接人工合成寡核苷酸序列[6]
,然后通過計(jì)算機(jī)控制的三坐標(biāo)工作平臺(tái)用特殊的針頭和微噴頭分別把不同的探針溶液逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍以及其它固相基片表面的不同位點(diǎn)上,通過物理和化學(xué)的方法使之固定,該方法各技術(shù)環(huán)節(jié)均較成熟,且靈活性大,適合于研究單位根據(jù)需要自行制備點(diǎn)陣規(guī)模適中的基因芯片。(2)原位合成法[7~10]:該法是在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成寡核苷酸探針陣列
,目前應(yīng)用的主要有光去保護(hù)并行合成法,壓電打印合成法等待分析樣品的制備是基因芯片實(shí)驗(yàn)流程的一個(gè)重要環(huán)節(jié),靶基因在與芯片探針結(jié)合雜交之前必需進(jìn)行分離
、擴(kuò)增及標(biāo)記。標(biāo)記方法根據(jù)樣品來源、芯片類型和研究目的的不同而有所差異。通常是在待測樣品的PCR擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄過程中實(shí)現(xiàn)對靶基因的標(biāo)記。對于檢測細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)水平的芯片,一般需要從細(xì)胞和組織中提取RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,并加入偶聯(lián)有標(biāo)記物的dNTP,從而完成對靶基因的標(biāo)記過程[11],對于陣列密度較小的芯片可以用同位素,所需儀器均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用設(shè)備,易于開展相關(guān)工作,但是在信號檢測時(shí),一些雜交信號強(qiáng)的點(diǎn)陣容易產(chǎn)生光暈,干擾周圍信號的分析。高密度芯片的分析一般采用熒光素標(biāo)記靶基因,通過適當(dāng)內(nèi)參的設(shè)置及對熒光信號強(qiáng)度的標(biāo)化可對細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量檢測。近年來運(yùn)用的多色熒光標(biāo)記技術(shù)可更直觀地比較不同來源樣品的基因表達(dá)差異,即把不同來源的靶基因用不同激發(fā)波長的熒光素標(biāo)記,并使它們同時(shí)與基因芯片雜交,通過比較芯片上不同波長熒光的分布圖獲得不同樣品間差異表達(dá)基因的圖譜[12,13],常用的雙色熒光試劑有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。對多態(tài)性和突變檢測型基因芯片采用多色熒光技術(shù)可以大大提高芯片的準(zhǔn)確性和檢測范圍,例如用不同的熒光素分別標(biāo)記靶序列及單堿基失配的參考序列,使它們同時(shí)與芯片雜交基因芯片與靶基因的雜交過程與一般的分子雜交過程基本相同,雜交反應(yīng)的條件要根據(jù)探針的長度
2 基因芯片的應(yīng)用
基因表達(dá)圖譜的繪制是目前基因芯片應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域,也是人類基因組工程的重要組成部分,它提供了從整體上分析細(xì)胞表達(dá)狀況的信息
目前
定量監(jiān)測大量基因表達(dá)水平在闡述基因功能
Golub等應(yīng)用cDNA 芯片檢測基因表達(dá)的差異進(jìn)行癌癥的分類
目前
基因芯片的另一重要應(yīng)用是基因多態(tài)位點(diǎn)及基因突變的檢測,現(xiàn)有大量實(shí)例說明
Lipshutz等人采用含18,495個(gè)寡核苷酸探針的微陣列
隨著大量疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn),變異與多態(tài)性分析將在疾病的診斷與治療方面體現(xiàn)出越來越重要的價(jià)值
芯片技術(shù)中雜交測序技術(shù)(sequencing by hybridization,SBH)是一種新的高效快速測序方法,也是基因芯片的另一重要應(yīng)用[24]
3 結(jié)束語
基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)不過短短幾年時(shí)間
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。俄羅斯科學(xué)院恩格爾哈得分子生物學(xué)研究所和美國阿貢國家實(shí)驗(yàn)室(ANL)的科學(xué)家們最早在文獻(xiàn)中提出了用雜交法測定核酸序列(SBH)新技術(shù)的想法
。當(dāng)時(shí)用的是多聚寡核酸探針。幾乎與此同時(shí)英國牛津大學(xué)生化系的Sourthern等也取得了在載體固定寡核苷酸及雜交法測序的國際專利。在這些技術(shù)儲(chǔ)備的基礎(chǔ)上,1994年在美國能源部防御研究計(jì)劃署、俄羅斯科學(xué)院和俄羅斯人類基因組計(jì)劃1000多萬美元的資助下研制出了一種生物芯片,并用于檢測盡地中海病人血樣的基因突變,篩選了一百多個(gè)外地中海貧血已知的突變基因。這種生物芯片的基因譯碼速度比傳統(tǒng)的Sanger和MaxaxGilbert法快1000倍,是一種有希望的快速測序方法。 搶先發(fā)展技術(shù),盡快占領(lǐng)市場是市場經(jīng)濟(jì)競爭中取得勝利的信條。生物芯片目前正處于激烈的技術(shù)競爭狀態(tài)中。Packard儀器公司發(fā)展的是診斷用的以凝膠為基礎(chǔ)的中等密度的芯片。而Affymetrix公司則已成功地應(yīng)用了光導(dǎo)向平板印刷技術(shù)直接在硅片上合成寡核苷酸點(diǎn)陣的高密度芯片而領(lǐng)先于芯片分析領(lǐng)域。該公司與惠普公司合作開發(fā)出專用的能掃描40萬點(diǎn)點(diǎn)陣的基因芯片掃描儀,同時(shí)又開發(fā)出同時(shí)可平行通過幾塊芯片的流路工作站和計(jì)算機(jī)軟件分析系統(tǒng)。組合成一套較完整的芯片制造、雜交、檢測掃描和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
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